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May 30, 2023

OrganoidChip facilita el hidrogel

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 11268 (2023) Cita este artículo 2350 Accesos 12 Detalles de Altmetric Metrics Los organoides son estructuras tridimensionales de agregados celulares autoensamblados

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11268 (2023) Citar este artículo

2350 Accesos

12 altmétrico

Detalles de métricas

Los organoides son estructuras tridimensionales de agregados celulares autoensamblados que imitan características anatómicas de órganos in vivo y pueden servir como modelos de órganos miniaturizados in vitro para pruebas de fármacos. La forma más eficaz de estudiar la toxicidad y eficacia de los fármacos requiere imágenes de alta resolución de una gran cantidad de organoides adquiridas en el menor tiempo posible. Actualmente faltan plataformas adecuadas capaces de obtener imágenes de organoides a un ritmo rápido y de alto contenido. Para abordar esta brecha de conocimiento, presentamos OrganoidChip, una plataforma de imágenes de microfluidos que incorpora un diseño único para inmovilizar organoides para obtener imágenes rápidas y de punto final. El chip contiene seis áreas de captura paralelas, cada una con una cámara de preparación e inmovilización, que recibe los organoides transferidos desde sus placas de cultivo nativas y los ancla, respectivamente. Primero demostramos que OrganoidChip puede inmovilizar eficientemente organoides intestinales y cardíacos sin comprometer su viabilidad y funcionalidad. A continuación, mostramos la capacidad de nuestro dispositivo para evaluar las respuestas dependientes de la dosis de la viabilidad de los organoides y las propiedades de contracción espontánea al tratamiento con doxorrubicina y obtener resultados similares a los experimentos fuera del chip. Es importante destacar que el chip permite obtener imágenes de organoides a velocidades que son un orden de magnitud más rápidas que las plataformas de imágenes convencionales y evita la adquisición de imágenes borrosas causadas por la deriva, la natación y los movimientos rápidos del escenario de los organoides. En conjunto, OrganoidChip es una plataforma de microfluidos prometedora que puede servir como componente básico para un formato de placa multipocillo que puede proporcionar imágenes de organoides de alto rendimiento y alta resolución en el futuro.

En los últimos años, la tecnología de organoides ha surgido como un modelo in vitro avanzado que puede recapitular las características inherentes del tejido de su órgano correspondiente1. Interrogar varios tipos de células y comprender los fenómenos que ocurren dentro del microambiente organoide requiere imágenes de alto contenido (HCI). Para lograr este objetivo, se necesitan plataformas que permitan obtener imágenes de las muestras en alta resolución y alto rendimiento de manera automatizada, eficiente y rápida. Los dispositivos de fondo plano que inmovilizan organoides en ubicaciones predeterminadas son esenciales para la HCI.

Las tecnologías existentes sólo cumplen parcialmente todos los requisitos de HCI. Por ejemplo, las placas multipocillos son un medio convencional para el cultivo y la detección de organoides de alto rendimiento (es decir, formatos de 96, 384 y 1536 pocillos). Estas placas tienen pocillos con fondos redondos en forma de U, V o M (p. ej., Elplasia® y Aggrewell™) que facilitan la formación de organoides (o esferoides) mediante autoensamblaje2,3,4. Sin embargo, la desviación del fondo plano en estos pozos introduce aberraciones y no permite obtener imágenes de alta resolución de los organoides5. Para combatir este problema, los usuarios deben transferir organoides a una placa multipocillo con una superficie de vidrio de fondo plano para obtener imágenes confocales y de alta resolución2. Incluso si la transferencia de organoides se logra con éxito, las placas multipocillos de fondo plano son susceptibles a la deriva de organoides durante movimientos rápidos de la etapa o a la convección natural dentro de los pocillos durante la obtención de imágenes. Estos movimientos de la muestra dificultan significativamente la obtención de imágenes volumétricas y de alta resolución de organoides grandes que requieren la captura de múltiples campos de visión (FOV) y pilas z para obtener imágenes de un organoide completo. Además de la deriva, localizar cada organoide dentro de un pozo completo requiere mucho tiempo y trabajo. Este proceso requiere cambiar entre objetivos de bajo y alto aumento y reenfocar repetidamente para determinar la posición del organoide. Otro inconveniente de las placas multipocillos de fondo plano radica en el riesgo de que algunos organoides se ubiquen en los bordes de los pocillos, lo que da como resultado imágenes distorsionadas y de bajo contraste.

Los nuevos diseños de microfluidos6,7, incluido el sistema Pu.MA8 y algunas otras plataformas, como las placas Akura5 (InSphero AG), han superado los problemas antes mencionados hasta cierto punto al colocar organoides en pocillos de menor diámetro (~ 0,4–4 mm4,5 ,6,7,8). Esta característica mantiene los organoides dentro de un campo de visión limitado y elimina la necesidad de localizarlos. Sin embargo, estos pequeños pozos sólo permiten obtener imágenes de baja resolución, ya que los organoides no están estacionarios dentro del FOV. Por lo tanto, los organoides aún pueden moverse debido a los movimientos rápidos de la placa o de la etapa, la perfusión basada en la inclinación dentro del chip de microfluidos y cualquier movimiento intrínseco de la muestra, como es el caso de los organoides cardíacos que se contraen espontáneamente.

El método de inmovilización más común implica incrustar o formar organoides dentro de hidrogeles que permiten su obtención de imágenes, aunque a resoluciones reducidas1,9. Dichos métodos de inmovilización basados ​​en hidrogeles no proporcionan control sobre la ubicación de los organoides dentro de los hidrogeles. Muy a menudo, los organoides se distribuyen aleatoriamente dentro del hidrogel a diferentes distancias del objetivo del microscopio y de los FOV. Esta distribución aleatoria da como resultado tiempos de obtención de imágenes más prolongados para localizar los organoides dentro del hidrogel y requiere objetivos de larga distancia de trabajo que comúnmente tienen resoluciones de imágenes limitadas.

Para abordar estos desafíos, presentamos un nuevo chip de imágenes de microfluidos, llamado OrganoidChip, con un diseño novedoso que no requiere el uso de hidrogeles para obtener imágenes de alta resolución. El chip recibe organoides de sus placas de cultivo convencionales en las que se convirtieron en organoides y se trataron con medicamentos, y los mantiene de manera constante dentro de sus cámaras de inmovilización para facilitar las imágenes transitorias de calcio y de vivo/muerto (Fig. 1). Diseñamos el chip con seis áreas de captura (TA) en paralelo, cada una de las cuales consta de dos cámaras consecutivas: la cámara de preparación (SC) y la cámara de inmovilización (IC). Las cámaras se diseñaron para comprimir ligeramente los organoides lateral y/o verticalmente para proporcionar la fricción necesaria para inmovilizar completamente los organoides durante la obtención de imágenes y evitar la borrosidad debido a cualquier movimiento de organoides en el chip. Las ubicaciones predeterminadas de las cámaras de inmovilización aceleran el proceso de obtención de imágenes al eliminar la necesidad de escanear un campo de visión grande para localizar los organoides y cambiar entre objetivos de aumento bajo y alto durante la obtención de imágenes de alta resolución. Como prueba de concepto, demostramos las capacidades únicas del OrganoidChip al inmovilizar con éxito organoides cardíacos e intestinales que fueron tratados con un fármaco quimioterapéutico, la doxorrubicina (DOX), en concentraciones crecientes. Esta plataforma permite el análisis basado en imágenes del tratamiento DOX, lo que demuestra valores de concentraciones inhibidoras del 50 % (IC50) que son comparables a los resultados fuera del chip.

Un diagrama de flujo que describe los pasos principales de los experimentos de OrganoidChip (a) y diversas fuentes de imágenes borrosas y pérdida de datos causadas por la falta de una inmovilización adecuada (b). (a) Los organoides se cultivaron en placas de varios pocillos y luego se expusieron a DOX durante 48 h. Posteriormente, se introdujeron organoides en el OrganoidChip para su inmovilización, seguido de transitorios de calcio (organoides cardíacos) e imágenes vivas/muertas. (b) La figura tiene tres filas, cada una de las cuales representa un mecanismo que altera las imágenes de alta resolución. La fila superior muestra la deriva causada por convección natural dentro del pozo de una cámara deslizante durante 5 s. La fila del medio ilustra cómo los movimientos rápidos del escenario pueden causar desenfoque cuando se tienen tiempos de exposición cortos. Normalmente, los impulsos más grandes y los tiempos de exposición más cortos (que se muestran como "ex" en la figura) dan como resultado un mayor desenfoque. La fila inferior muestra cuánto puede impulsarse o “nadar” un organoide cardíaco en 15 s en una placa de Petri durante la obtención de imágenes de transitorios de calcio. Las barras de escala representan 200 µm.

Fabricamos el chip de microfluidos haciendo un molde de tres capas producido por fotolitografía de fotorresistentes negativos SU8-2050 y SU8-2100, seguida de una litografía suave de polidimetilsiloxano (PDMS). Durante la fabricación se apilaron tres capas de fotoprotección, con alturas de 100, 190 y 260 µm, para proporcionar alturas de canal de 100, 290 y 550 µm, respectivamente, en nuestro dispositivo. Brevemente, se deshidrató una oblea de silicio de 4 pulgadas (STK9671-1, Nova Electronic Materials) en una placa caliente a 120 °C durante 30 minutos y se instaló en una recubridora giratoria. Dependiendo del espesor de capa deseado, vertimos 4 ml de SU8-2050 o SU8-2100 en el centro y centrifugamos. La oblea se sacó con cuidado de la recubridora giratoria y se horneó suavemente. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la oblea se expuso a los rayos UV a través de la máscara de mylar impresa de alta resolución de la capa específica. La oblea fotoprotectora se reveló solo después de la primera y tercera exposición a los rayos UV (consulte la Tabla complementaria S1 para conocer las cantidades de tiempo, temperatura, etc., utilizadas en la fabricación). El molde se salinizó usando (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHIDROOCTYL)TRICHLOROSIL-ANE (Gelest, Inc.) durante 72 h para facilitar la separación adecuada del molde del PDMS.

Para la litografía blanda, el polímero base y el agente de curado se mezclaron en una proporción de 10:1 (p/p). La mezcla se desgasificó en una cámara de vacío y luego se vertió lentamente sobre el molde, seguido de un horneado a 75 °C durante 6 h. El PDMS se despegó, se perforó para los tubos de entrada y salida y se unió a un cubreobjetos n.º 1,5 utilizando un tratamiento con plasma de oxígeno para formar el chip.

La Fig. 2a presenta la configuración de microfluidos. El flujo en el chip se reguló mediante un controlador de presión de aire (ITV0010-3UBL, SMC) capaz de entregar presiones entre 0,01 y 1 bar. La salida del regulador se conectó a dos depósitos llenos de medio de cultivo para establecer un flujo impulsado por presión. Los depósitos y el chip se conectaron a dos válvulas solenoides para crear un puente H fluídico. Con este diseño, podríamos invertir la dirección del flujo dentro del chip en cualquier momento controlando las válvulas solenoides usando una tarjeta DAQ (NI USB-6009) y un programa LabVIEW (versión 13.0f2).

Diseño de dispositivo microfluídico de OrganoidChip y su configuración para inmovilizar múltiples organoides para obtener imágenes nítidas. (a) La configuración de microfluidos que permite el control del flujo hacia adelante y hacia atrás (azul y naranja, respectivamente) dentro del chip se facilitó mediante la creación de un puente H fluídico utilizando dos válvulas solenoides. (b) Un esquema de vista lateral del chip, que demuestra su funcionamiento. Los organoides se pipetean en el barril de vidrio que está instalado en la parte superior de la entrada del chip, se cargan en el área principal y se inmovilizan en el área de captura (TA) dentro de la cámara de preparación (SC) o la cámara de inmovilización (IC), lo que permite obtener imágenes sin borrosidades. (c) Una imagen del chip completo; su altura cambia y sus diversas secciones con cuadros discontinuos de varios colores, el área principal (naranja), SC (verde), IC (azul), TA (rojo), cámara de salida (naranja) y el canal de salida serpentino con un ancho de 315 µm y una longitud de 71 mm. En el lado derecho de la figura, un perfil muestra las variaciones de altura comenzando desde el área principal y extendiéndose hasta el canal de salida. Se unieron varias imágenes para formar la imagen de un chip completo. La barra de escala representa 1 mm.

Antes de cargar los organoides, el chip se sometió a varios pasos de perfusión. Primero se perfundió el dispositivo con agua desionizada para eliminar las burbujas de aire, seguido de esterilización con alcohol etílico y, por último, con medio de cultivo. Se conectó un barril de vidrio (Precigenome LLC) mediante Luer Lock al tubo que suministra el medio de cultivo y se montó en la entrada del chip, sirviendo como depósito de nutrientes. El barril de vidrio también sirvió como punto de acceso para cargar los organoides y los tintes fluorescentes en el chip (Fig. 2a, b). Para establecer un flujo impulsado hidrostáticamente dentro del OrganoidChip, que era necesario cuando se usaba un barril de vidrio abierto, colocamos el depósito de desechos 10 cm por debajo del nivel del chip. Esta diferencia de altura proporcionó un caudal de 16 µl/min en el chip. El flujo impulsado hidrostáticamente se inició abriendo la válvula solenoide que conectaba la salida del chip al depósito de desechos.

Se utilizaron células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) transfectadas con CMV-GCaMP2, un regalo del Dr. Bruce Konklin, para generar organoides cardíacos y visualizar transitorios espontáneos de calcio intracelular. Las hiPSC se mantuvieron en medios Complete Essential 8 (E8, StemCell Technologies) en placas de cultivo recubiertas con vitronectina. Antes de la diferenciación cardíaca, se sembraron hiPSC en placas multipocillo recubiertas con Matrigel a una densidad de siembra de 3,16 × 105 células/cm2. Al alcanzar una confluencia del 80%, la diferenciación cardíaca se inició mediante la modulación de la vía WNT/β-catenina22.

Se recolectaron cardiomiocitos que latían espontáneamente utilizando Accutase (StemCell Technologies) 21 días después del inicio de la diferenciación. Las células se sembraron a diferentes densidades celulares en placas de 96 pocillos de fondo redondo con fijación ultrabaja (Nexcelom Biosciences). A continuación, las placas sembradas se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos para facilitar la agregación celular. Los organoides se cultivaron en suspensión durante 48 h en medio RPMI-1640 (Hyclone™) suplementado con B-27 con insulina (Gibco™) e inhibidor ROCK 10 µM, para promover la viabilidad celular y la formación de organoides. Posteriormente, los medios se reemplazaron con medios sin inhibidor de ROCK y los organoides se mantuvieron en pocillos individuales hasta que se transfirieron a portaobjetos de cámara para el tratamiento con DOX seguido de la carga de chips.

La recolección y el análisis de muestras de biopsia intestinal de perros fueron aprobados previamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Iowa (ISU) (IACUC-19–102; IP: Albert E. Jergens). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de IACUC según lo exigen las regulaciones federales de EE. UU. (Fish, 2004). El estudio se informa de acuerdo con las directrices ARRIVE (https://arriveguidelines.org)23.

Utilizamos criptas intestinales caninas que contienen células madre LGR5+ para facilitar la rápida creación de organoides intestinales maduros9. Las criptas intestinales caninas se obtuvieron a partir de biopsias endoscópicas de caninos adultos sanos en la Universidad Estatal de Iowa (IACUC-22-050). Los organoides maduros que contienen vellosidades, criptas y luces se pueden producir normalmente entre 3 y 6 días después de un pasaje4,24. En el momento de la siembra, las criptas intestinales caninas se suspendieron en Matrigel (Corning® Matrigel® GFR) y se dispensaron en gotas de 20 µl en una placa de 24 pocillos. Normalmente, cada almohadilla de Matrigel contenía entre 20 y 25 organoides. Cuando los organoides superaron los 400 µm, empleamos una proporción de división de 1:3. Después de una incubación de 10 minutos a 37 °C y 5% de CO2, se agregaron a cada pocillo 0,5 ml del medio completo con factores de crecimiento (CMGF+) que contenía inhibidor de ROCK 10 µM y inhibidor de GSK3β 2,5 µM y se mantuvo durante 48 h. A continuación, el medio se reemplazó con CMGF+ fresco sin inhibidores de ROCK y GSK3β y se actualizó continuamente cada 48 h durante 7 días. Los organoides en las almohadillas de Matrigel se pasaron y expandieron el día 7.

Para pasar los organoides, primero se recuperaron de las almohadillas de Matrigel. Brevemente, las almohadillas de Matrigel se disociaron retirando primero el medio gastado y agregando 0,5 ml de medio completo sin factores de crecimiento (CMGF-) a 4 °C a cada pocillo para pipetear toda la almohadilla de Matrigel hasta que se rompió y se separó de la placa de pocillos. . Luego, la suspensión se centrifugó a 100 g durante 5 min a 4 °C y se eliminó el sobrenadante.

Para el pase, se añadió 1 ml de TrypLE Express (Gibco, ThermoFisher Scientific) al sedimento y se incubó a 37 °C y 5% de CO2 durante 10 minutos. Después de la centrifugación a 100 g durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y se reemplazó con 5 ml de CMGF- para detener la disociación. Un paso de centrifugación adicional reemplazó el CMGF- con la cantidad necesaria de Matrigel a 4 °C (dependiendo del número de células). La suspensión se distribuyó en una placa de 24 pocillos en forma de gotitas de 15 a 20 µl. La placa se incubó a 37 °C y 5% de CO2 durante 10 minutos para permitir la solidificación de Matrigel; luego, se agregaron 500 µl de CMGF+ a cada pocillo para cultivo adicional. Las almohadillas de Matrigel se limpiaron 3 o 4 días después de cada paso para eliminar los restos celulares muertos y degenerativos, así como los organoides muy pequeños9. El proceso de limpieza incluyó todos los pasos descritos anteriormente para la recuperación de organoides de las almohadillas de Matrigel, excepto el tratamiento TrypLE Express.

Antes del tratamiento con DOX, los organoides intestinales se pasaron 3 veces y posteriormente se cultivaron durante 7 días, realizándose una limpieza el día 5 para obtener el tamaño y la morfología de organoides adecuados. Para la carga de chips, primero se recuperaron organoides intestinales de las almohadillas de Matrigel, como se describió anteriormente. Se requirió un paso adicional para disociar completamente cualquier Matrigel restante en los organoides. Este paso fue fundamental para evitar cualquier aglomeración de organoides. Específicamente, agregamos 1 ml de solución de recuperación celular (Corning Inc.) al sedimento centrifugado, pipeteamos varias veces y luego incubamos los organoides recuperados a 4 °C durante 30 minutos para disociar completamente cualquier Matrigel que todavía estuviera adherido al organoides. Después de una centrifugación adicional a 100 g durante 5 minutos a 4 °C, el sedimento con organoides limpios se recuperó en CMGF y se transfirió a una placa de Petri para cargarlo en el chip.

Utilizamos organoides de 300 a 500 µm de diámetro para el tratamiento con DOX (0,1% (v/v) en DMSO; Figura complementaria S1) durante 48 h. Los organoides cardíacos se transfirieron primero desde placas de 96 pocillos de fondo redondo a portaobjetos de cámara (Ibidi Inc.) con un cubreobjetos de vidrio de 170 µm de espesor para permitir imágenes sin aberraciones. Antes del tratamiento con DOX, los organoides cardíacos se incubaron durante la noche en portaobjetos con cámara de 8 pocillos y se tomaron imágenes para detectar transitorios de calcio y campo claro. Estas mediciones sirvieron como base para analizar la cardiotoxicidad del DOX. Los organoides cardíacos se trataron con DOX 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 5 y 10 µM. Los organoides intestinales se sometieron a DOX 0, 0,1, 0,3, 1 y 2 µM dentro de almohadillas Matrigel en su placa nativa de 24 pocillos. La concentración máxima a la que fueron sometidos los organoides intestinales fue ligeramente menor debido a su mayor sensibilidad al DOX25,26.

Realizamos imágenes de lapso de tiempo de calcio de 10 segundos de duración de organoides cardíacos antes y 48 h después del tratamiento con DOX para monitorear el cambio en la cinética de latidos de los organoides en portaobjetos de cámara (datos de cinética de latidos fuera del chip). Luego, los mismos organoides se transfirieron al chip y se les permitió habituarse en los TA durante 100 minutos antes de obtener imágenes en el chip. Durante las sesiones de imágenes, los organoides cardíacos en los portaobjetos de la cámara y los chips se mantuvieron a 37 °C en una miniincubadora humidificada (TA-MI-20 × 46, herramientas de Bioscience). La Figura complementaria S1 presenta un diagrama de flujo detallado que describe todo el tratamiento con DOX y las imágenes de calcio de los organoides cardíacos en portaobjetos de cámara y el OrganoidChip.

Para analizar los cambios en la cinética de latidos de los organoides cardíacos, se identificaron regiones dentro del organoide que demostraron transitorios de calcio y se monitorearon sus señales promedio a través de imágenes de lapso de tiempo. Las formas de onda de latido, extraídas de estas regiones, se utilizaron para estimar varios parámetros cinéticos de latido utilizando un código MATLAB interno. Específicamente, medimos la tasa de latidos (BR) y la relación entre el cambio en la intensidad de la fluorescencia del calcio y la intensidad inicial (ΔF/F0). También estimamos el porcentaje de tiempo de batido (BT75) y la potencia de batido (FBT75) definidos por:

donde \({T}_{BR}\) representa el período de latido promedio de un organoide y \({T}_{75}\) representa la duración promedio del latido hasta que la amplitud de fluorescencia del GCaMP cae en un 75% (Figura complementaria S2). Luego calculamos los cambios fraccionarios (\(\Delta \left(X\right)\)) de varios parámetros para cada organoide individual de acuerdo con:

donde \({X}_{pre\_tx}\) representa el pretratamiento y \({X}_{post\_tx}\) representa los valores post-tratamiento del parámetro específico. La medición de los valores previos y posteriores al tratamiento nos obligó a realizar un seguimiento de los organoides individuales a medida que se transferían desde el portaobjetos de la cámara al chip observando su forma, área y brillo.

Teñimos los organoides atrapados en el chip usando Calcein AM (Invitrogen™), Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) (Invitrogen™, Waltham, MA) y Hoechst 33,342 (ThermoFisher Scientific Inc.) para etiquetar células vivas y células muertas. y los núcleos celulares, respectivamente. Todos los colorantes se administraron a 2 µM, según el protocolo del fabricante, en medios de cultivo. Los tintes se introdujeron en el chip a través del barril de vidrio reemplazando los medios de cultivo con soluciones de tinte y aplicando un flujo impulsado hidrostáticamente en un ciclo de encendido y apagado (1 min encendido y 10 min apagado) durante un total de 50 min. Utilizamos un caudal de 16 µl/min, que fue suficiente para reemplazar todo el volumen del chip de ~ 7,7 µl en menos de 1 min. Antes de la obtención de imágenes, perfundimos el chip con medio de cultivo nuevo durante 2 minutos para eliminar cualquier tinte no unido y minimizar la señal de fondo de la imagen. Tomamos imágenes de los organoides utilizando microscopías de fluorescencia confocales y de campo amplio.

Para controlar el impacto del OrganoidChip, se tiñó y se tomaron imágenes de un subconjunto de organoides cardíacos e intestinales fuera del chip (denominado "fuera del chip"). Los organoides fuera del chip se trataron de manera similar con tintes 2 µM, seguido de una incubación de 50 minutos a 37 °C. Se tomaron imágenes de los organoides cardíacos e intestinales fuera del chip en portaobjetos de cámara de fondo plano de 8 pocillos y dentro de las almohadillas Matrigel en placas de 24 pocillos, respectivamente.

Para el análisis de viabilidad, primero creamos una máscara, utilizando la imagen de campo claro, para definir los límites de los organoides. Utilizamos la máscara en las imágenes de proyección de máxima intensidad para calcular la intensidad media de las señales vivas (Sgreen) y muertas (Sred) de los píxeles dentro de la máscara y definimos la relación de viabilidad (VR) de cada organoide de acuerdo con:

Para los experimentos de tratamiento DOX, normalizamos la VR de cada organoide por la VR promedio de los organoides de control del vehículo para obtener el porcentaje de viabilidad con respecto al control.

Se utilizó una cámara digital CMOS ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU (Hamamatsu Photonics KK) junto con un microscopio invertido IX73 (Olympus) para obtener imágenes de campo amplio y de fluorescencia. Se utilizó una platina automatizada SERIE PZU-2000 XYZ con un controlador de platina multieje ASI MS-2000-WK para obtener imágenes y posicionamiento automatizados de las placas de pocillos y el chip durante la obtención de imágenes en el microscopio invertido. Se obtuvieron imágenes de lapso de tiempo a 100 fps para capturar los transitorios de calcio (10 ×, objetivo 0,3NA, Olympus). Toda la configuración de imágenes se controló mediante un programa casero LabVIEW (NI, EE. UU.).

Se realizaron imágenes confocales de organoides atrapados en el chip (Leica TAS SP8) inmediatamente después de las imágenes vivas/muertas en el microscopio de campo amplio. Las imágenes z de Calcein AM (excitación: 488 nm, filtro de paso de banda: 493–547 nm), EthD-1 (excitación: 552 nm, filtro de paso de banda: 557–784 nm) y Hoechst (excitación: 405 nm, filtro de paso de banda : 410–483 nm) se capturaron con tamaños de paso de 5 y 3 µm utilizando los objetivos de 10 × y 40 ×, respectivamente. Todo el procesamiento de imágenes se realizó con ImageJ (NIH).

Utilizamos OriginPro (OriginLab Corporation, versión 9.9.0.225) para realizar análisis estadísticos, ajuste de curvas para las evaluaciones de dosis-respuesta y cálculos de IC50. Calculamos los valores de p para las comparaciones de grupos utilizando pruebas t o pruebas F donde p < 0,05 (*) y p < 0,005 (**) se consideraron significativos, después de verificar los supuestos de normalidad y comprobar la igualdad de varianzas. El modelo sigmoideo Imax y los parámetros de regresión se informan en la ecuación complementaria. S1 y Tabla S2. Los puntos de datos en las curvas y tablas se representan como media ± error estándar de la media (SEM).

Los métodos convencionales para obtener imágenes de organoides resultan desafiantes debido a las ubicaciones aleatorias de los organoides dentro de los pocillos de una placa multipocillo y su propensión al movimiento durante la obtención de imágenes. En primer lugar, la convección natural o los movimientos rápidos de la etapa pueden provocar un flujo de medios a granel, lo que podría provocar que un organoide se desplace dentro o incluso fuera del FOV. La deriva del organoide puede dar como resultado la captura de imágenes borrosas, mientras que, además, el plano focal del organoide cambia constantemente durante su movimiento en los medios de cultivo (Fig. 1b, Video complementario S1). Demostramos el desenfoque causado por los movimientos rápidos del escenario al recuperar primero los organoides intestinales de su Matrigel nativo, introduciéndolos en un portaobjetos de cámara y capturando imágenes con varios tiempos de exposición (10 a 100 ms) inmediatamente después de cada movimiento del escenario. Las imágenes resultantes mostraron que los organoides más grandes con mayores impulsos estaban sujetos a movimientos más grandes después de que el escenario se detuvo y crearon desenfoques no despreciables en las imágenes (Fig. 1b; para más detalles, consulte la Figura complementaria S3). Para eliminar este problema, es necesario reducir la velocidad de la etapa o agregar un tiempo de espera para que los organoides se asienten antes de tomar la siguiente imagen, lo que aumenta el tiempo total de obtención de imágenes, especialmente para ensayos de alto rendimiento.

Por otro lado, los organoides que se contraen espontáneamente pueden moverse o nadar dentro del campo de visión, lo que da como resultado imágenes capturadas borrosas durante la toma de imágenes en lapso de tiempo. Este desafío es especialmente evidente cuando se obtienen imágenes de los transitorios de calcio en nuestros organoides cardíacos que se contraen espontáneamente, en los que la región fluorescente de interés está sujeta a un movimiento significativo. La Figura 1b y el video complementario S2 muestran un organoide cardíaco que se impulsa en medios de cultivo en un portaobjetos de cámara, como lo demuestran las ráfagas de movimiento que experimenta después de sus contracciones. Monitorear la región de interés en movimiento requerirá un posprocesamiento significativo. Más importante aún, la falta de una inmovilización total puede provocar que una muestra se desvíe o se salga completamente del campo de visión, lo que provocará una pérdida total de datos. Por el contrario, presentamos los videos complementarios S3 y S4 que muestran los videos de campo brillante y fluorescencia, respectivamente, de un organoide fuertemente contraído que permanece inmovilizado en un área de captura (TA), lo que demuestra la ventaja del OrganoidChip sobre las plataformas de imágenes convencionales.

El OrganoidChip fue diseñado para abordar los desafíos asociados con los movimientos de los organoides a través de una geometría única para facilitar la inmovilización de los organoides en ubicaciones predeterminadas. Si bien la inmovilización de organoides evita cualquier movimiento, las ubicaciones conocidas de los organoides inmovilizados eliminan la laboriosa búsqueda de organoides durante la obtención de imágenes.

El chip consta de cuatro secciones: (i) área principal, (ii) TA, (iii) cámara de salida y (iv) canal de salida (Fig. 2c). El área principal actúa como difusor al expandir el flujo desde la entrada del chip a las cámaras, facilitando la distribución de organoides entre los TA cuando ingresan al chip. Aquí, demostramos un diseño de chip con 6 TA paralelos. Este diseño garantiza que cada TA atrapará solo un organoide. Cuando un TA recibe un organoide, su resistencia hidráulica aumenta; por lo tanto, el flujo dirige los otros organoides hacia los TA desocupados (película S1). Cada TA consta de una cámara de preparación (SC), seguida de una cámara de inmovilización (IC) (Fig. 2c). Los SC tienen la misma altura que el área principal para infligir una resistencia mínima durante la carga organoide inicial. Posteriormente, los organoides se desplazan hacia CI que tienen alturas reducidas que permiten una ligera compresión y aplanamiento de los organoides. El ancho del IC (650 µm) es mayor que el de los SC (430 µm) para tener en cuenta cualquier expansión que pueda surgir de esta compresión vertical. La fricción estática resultante asegura los organoides en su lugar y los deja estacionarios durante la obtención de imágenes motorizadas rápidas. Las dimensiones del CI se adaptan a organoides de varios tamaños, siempre que puedan ingresar al CI. Los organoides con diámetros mayores que el ancho de los SC comúnmente no ingresan a los IC y se mantienen en su lugar mediante una ligera compresión lateral de las paredes laterales de los SC, lo que aún permite la inmovilización para obtener imágenes.

Los circuitos integrados están conectados a la cámara de salida a través de un canal estrecho que evita que los organoides escapen de los circuitos integrados (Fig. 2c y Figura complementaria S4). La cámara de salida está conectada a la salida a través de un canal serpenteante de 71 mm de largo y altura reducida (100 µm). Este diseño proporciona la resistencia hidráulica necesaria para controlar y mantener los bajos caudales necesarios dentro del chip. Implementamos la reducción de altura dentro de la parte ancha de la cámara de salida para evitar que pequeños agregados de desechos celulares, que podrían escapar de los circuitos integrados, obstruyan el canal de salida (Fig. 2c y Figura complementaria S4).

Múltiples organoides alojados dentro de dos TA adyacentes pueden caber dentro de un solo FOV del objetivo de 10 × (1,5 × 1,5 mm2), lo que facilita la obtención de imágenes de al menos dos organoides por FOV (con al menos un organoide por TA). Debido a que los TA mantienen los organoides en su lugar en ubicaciones conocidas, OrganoidChip elimina la engorrosa tarea de realizar escaneos repetidos en todo un pozo para ubicar las muestras, lo que resulta beneficioso para pantallas más grandes.

El OrganoidChip funciona bajo un flujo impulsado por presión, en lugar de utilizar caudales constantes (p. ej., una bomba de jeringa), para garantizar que el caudal disminuya cuando aumenta la resistencia hidráulica en el chip (Fig. 2a). Puede surgir un aumento de presión cuando todos los TA están ocupados por organoides, exponiéndolos potencialmente a una tensión de corte indeseablemente alta en un sistema impulsado por el caudal. Por lo tanto, utilizamos un flujo impulsado por presión que puede ajustar el caudal dentro del chip a medida que los TA se cargan con organoides. Una vez que todos los TA estén cargados con organoides, todavía habrá un pequeño caudal alrededor de los organoides para proporcionar un intercambio suficiente de nutrientes.

Desarrollamos un procedimiento de carga que se adapta a propiedades específicas de cada tipo de organoide. Para la carga, se retiró el tubo conectado a la parte superior del barril de vidrio y se pipetearon organoides en el barril de vidrio. Dependiendo del tamaño de los organoides disponibles, cargamos ~ 8 organoides en promedio. Transferimos los organoides cardíacos de los portaobjetos de la cámara al chip permitiéndoles asentarse en la base del barril sin presencia de flujo. Luego, los organoides se dirigieron suavemente hacia los TA utilizando presiones de hasta 0,15 bar, lo que corresponde a un caudal máximo de ~ 13 µl/min por TA. Con estos caudales, vimos un desprendimiento de células insignificante o nulo de los organoides, lo que indica que la tensión de corte impuesta no fue físicamente perjudicial para los organoides. La Figura 3a muestra un OrganoidChip con un solo organoide cardíaco que llena cada uno de los seis TA.

Caracterización del rendimiento de OrganoidChip. (a, b) Imágenes representativas que muestran organoides cardíacos (a) e intestinales (b) que se distribuyeron uniformemente entre los TA del chip. (c) La eficiencia de captura se informa como el número de TA llenos respecto al número total de TA (es decir, 6). Realizamos 11 conjuntos diferentes de experimentos con chips para organoides cardíacos y 8 para organoides intestinales. Las eficiencias de captura aumentaron significativamente cuando se utilizaron procedimientos de carga asistida de inversión de flujo y titulación de virutas (n = 6 TA por viruta). (d) Velocidad de latido de los organoides cardíacos en función del tiempo al cargarlos en el chip. Los datos no muestran cambios significativos en las tasas de latidos después de 70 minutos (n = 6 organoides por condición). Todas las comparaciones se realizaron mediante una prueba t de dos muestras, teniendo en cuenta la igualdad de varianzas. ( e, f ) Tinción con calceína AM y EthD-1 de los organoides cardíacos ( e ) e intestinales ( f ) (objetivo 20 ×) dentro y fuera del chip. (g) Los índices de viabilidad de los organoides obtenidos de 2 conjuntos diferentes de experimentos dentro y fuera del chip no muestran diferencias estadísticamente significativas (p = 0,40, sin chip = 18 y sin chip = 15 para organoides cardíacos; p = 0,36 , sin chip = 8 y sin chip = 9 para organoides intestinales). Todas las barras de escala representan 400 µm.

La carga de organoides intestinales resultó más desafiante ya que eran propensos a adherirse entre sí durante la carga de chips. Por lo tanto, después de la digestión de Matrigel en su placa nativa de 24 pocillos, los organoides intestinales se transfirieron a una placa de Petri y luego se pipetearon uno por uno en el barril de vidrio mientras se aplicaba un flujo impulsado hidrostáticamente. Cuando un organoide gravitó hacia el fondo del barril y entró en el chip, el flujo dirigió el organoide a un TA vacío. Los organoides se cargaron constantemente uno tras otro hasta que todos los TA se llenaron con al menos un organoide (Fig. 3b).

La Figura 3c muestra que la eficiencia de captura de organoides es del 68% en promedio durante la carga inicial en el dispositivo. Probamos otro chip con una mayor cantidad de TA y descubrimos que los organoides no se distribuían uniformemente entre los TA debido al gran ancho del chip, lo que resultaba en una baja eficiencia de captura27. Por lo tanto, disminuimos el ancho total y el ángulo de disminución del área principal al reducir el número de TA a seis, lo que aumentó la eficiencia general de captura. Ocasionalmente, dos o más organoides ingresaban a un solo TA, dejando algunos otros TA vacíos. Implementamos una estrategia de carga asistida para mejorar la eficiencia de captura y reducir el riesgo de que múltiples organoides queden atrapados en una sola cámara. Después de la carga inicial, invertimos el flujo para redirigir los organoides al área principal, inclinamos lateralmente el chip para redistribuirlos uniformemente entre los TA y reanudamos el flujo hacia adelante para guiar los organoides hacia los TA vacíos. Al utilizar este procedimiento de carga de asistencia, la eficiencia promedio de captura de organoides intestinales y cardíacos aumentó significativamente al 85% (Fig. 3c).

Para estudiar el efecto de la dinámica del flujo del chip y el proceso de carga sobre la funcionalidad de los organoides cardíacos, medimos los cambios en las tasas de latidos de los organoides mediante imágenes de lapso de tiempo. Sus velocidades de latido nativas fuera del chip promedio fueron de 55 latidos por minuto, medidas en placas de 96 pocillos utilizando BioTek Cytation 3. Cuando los organoides se transfirieron posteriormente al OrganoidChip y se distribuyeron entre los SC, sus velocidades de latido inicialmente disminuyeron debido al pipeteo. , cambios temporales de temperatura y exposición al flujo durante la carga. Sin embargo, dentro de los 70 minutos posteriores a la habituación dentro de la miniincubadora, sin flujo en el chip, las tasas de latidos de los organoides no mostraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a sus valores nativos (Fig. 3d). Durante los siguientes 80 minutos en los SC, sus ritmos de paliza se mantuvieron sin cambios.

Luego trasladamos los organoides a los circuitos integrados. Incluso después de 30 minutos de compresión en los circuitos integrados, las velocidades de latido de los organoides fueron similares a las medidas fuera del chip. Para investigar más a fondo el efecto aislado de la compresión en los organoides cardíacos, realizamos un experimento separado en una placa de Petri. Específicamente, comprimimos los organoides a una altura de 230 µm usando un cubreobjetos y monitoreamos sus velocidades de latido a lo largo del tiempo (Figura complementaria S5). Los resultados mostraron que las velocidades de paliza de los organoides comprimidos se acercaron a los niveles previos a la compresión en menos de 20 minutos, lo que coincide con nuestras observaciones en el chip.

A continuación, probamos si la carga y el flujo de organoides en el chip afectaban su viabilidad. Teñimos y tomamos imágenes de organoides tanto dentro como fuera del chip. Los organoides fotografiados fuera del chip sirvieron como controles.

Las figuras 3e, f muestran imágenes representativas de organoides sanos teñidos vivos y muertos. Los ratios de viabilidad, calculados aplicando la Ec. 4 en imágenes vivas/muertas, no muestran diferencias estadísticamente significativas entre los organoides dentro y fuera del chip (Fig. 3g). Estos resultados indican que los procesos de carga e inmovilización de chips no tienen efectos adversos notables sobre la viabilidad de los organoides. Además, estos resultados resaltan que nuestro dispositivo permite la tinción además de la obtención de imágenes de organoides. A pesar de los procesos adicionales a los que fueron sometidos los organoides intestinales, como los procesos de pipeteo y resuspensión necesarios para disolver Matrigel para obtener imágenes en el chip, sus índices de viabilidad no son significativamente diferentes a los de las imágenes fuera del chip. Estos resultados confirman además que los pasos adicionales necesarios para la carga del chip tampoco son perjudiciales para las células.

Evaluamos el rendimiento del OrganoidChip al evaluar la respuesta de toxicidad dependiente de la dosis de los organoides utilizando imágenes vivas y muertas. Las Figuras 4a, b presentan imágenes representativas de campo claro y fluorescencia viva/muerta de organoides tratados con DOX en diferentes concentraciones. La mayoría de los organoides se inmovilizaron con éxito en los circuitos integrados. Dado que los organoides intestinales eran más propensos a la aglomeración, independientemente de la concentración de DOX, ocasionalmente dos o más de ellos se adhirieron entre sí y permanecieron como grandes grupos en las SC (casos de tratamiento de 0,1 y 1,0 µM mostrados en la Fig. 4a). En concentraciones altas de DOX, los organoides cardíacos eran significativamente más pequeños (<350 µm) y parecían adherirse entre sí, como se puede ver en el caso de 10 µM de la Fig. 4b. Especulamos que las células muertas que se desprenden de la superficie de los organoides (observadas durante la exposición a DOX fuera del chip) contribuyeron a la reducción del tamaño, mientras que los cambios en las propiedades de la superficie y la presencia de ADN libre de las células disociadas causaron la aglomeración de organoides. Tener múltiples organoides en los TA (en IC o SC) no afectó negativamente la funcionalidad del chip. Se obtuvieron imágenes exitosas de los organoides mientras estaban inmovilizados en cualquiera de las cámaras de los TA.

Análisis de viabilidad dosis dependiente de los organoides intestinales y cardíacos después de 48 h de tratamiento con DOX. Imágenes de ejemplo de los organoides intestinales (a) y cardíacos (b) teñidos en OrganoidChip. Se tomaron imágenes de los organoides intestinales tratados con concentraciones de 0,3 y 2 µM en los chips con un diseño de canal de conexión más corto. (c) Las curvas de viabilidad para los resultados de tinción vivos (Calcein AM) y muertos (EthD-1) fuera y dentro del chip. La IC50 para las condiciones fuera y dentro del chip es de 0,22 y 0,18 µM para los organoides intestinales y de 0,73 y 0,69 µM para los organoides cardíacos, respectivamente. Los puntos de datos se representan con un ajuste de curva S (n ≥ 5 organoides por condición); (d) campo claro (I) y proyección de intensidad máxima (II) de las imágenes z confocales de organoides tratados con concentraciones de 0,3 µM (organoide intestinal) y 0,5 µM (organoide cardíaco) de DOX teñido con Hoechst (azul), EthD-1 (Rojo) y Calcein AM (Verde) (10 × objetivo); Se volvieron a obtener imágenes de las regiones naranja (III) y roja (IV) del organoide cardíaco utilizando un objetivo de 40 × y sus proyecciones de intensidad máxima se muestran en las subimágenes III y IV. Las barras de escala para imágenes de 10 × (en las figuras a, b y d) y de 40 × (en la figura d) son 400 µm y 100 µm, respectivamente.

Las curvas dosis-respuesta vivo/muerto se obtuvieron ajustando un modelo Imax sigmoidal (curva S) a los puntos de datos de viabilidad (Fig. 4c). En general, la forma de la curva en S ajustada fue más pronunciada para los organoides cardíacos que para los organoides intestinales. La viabilidad comienza a disminuir en el rango de 10 s de nM para los organoides intestinales, mientras que la caída comienza en los 100 s de nM para los organoides cardíacos, lo que implica que los organoides intestinales son más sensibles al tratamiento con DOX. Por ejemplo, los organoides cardíacos tratados con DOX 0,1 µM experimentan efectos marginales sobre la viabilidad celular y estos organoides exhiben casi la misma viabilidad que la condición tratada con DMSO. Por otro lado, tratar los organoides intestinales con la misma concentración de DOX reduce su viabilidad a ~65%. En tratamientos con concentraciones más altas de DOX, como 2 µM, la viabilidad de ambos tipos de organoides cae significativamente por debajo del 10%.

Con base en estas curvas, determinamos que los valores de DOX IC50 fuera y dentro del chip son 0,22 y 0,18 µM para los organoides intestinales, y 0,73 y 0,69 µM para los organoides cardíacos, respectivamente (Tabla complementaria S3). Estos resultados indican además que los organoides intestinales son más sensibles al tratamiento con DOX que los organoides cardíacos y muestran toxicidad en concentraciones más bajas. Las curvas de dosis-respuesta ajustadas para las pruebas dentro y fuera del chip no son estadísticamente diferentes (Tabla complementaria S4), lo que indica que los procesos de carga, inmovilización y tinción en el OrganoidChip no alteran los resultados de viabilidad de los organoides tratados con DOX. .

En la literatura, hay un número muy limitado de estudios que presentan valores de CI50 basados ​​en la viabilidad para organoides intestinales tratados con DOX utilizando células de origen humano y ninguno para organoides de origen canino. Uno de los estudios realizados en humanos analizó imágenes (4 × objetivo) de células teñidas con Phalloidin-FITC y Hoechst para encontrar viabilidad celular28. Estimamos que sus valores de IC50 eran inferiores a 1 µM, comparables a nuestros resultados. Se ha informado sobre el análisis de viabilidad de organoides cardíacos tratados con DOX utilizando diferentes métodos, como ensayos basados ​​en absorbancia29, tinción de fluorescencia viva/muerta3, citometría de flujo de células disociadas de organoides30 y parámetros cinéticos de latido (es decir, velocidad de latido, cambio de área, etc.). )13,31. Sin embargo, muchos de estos estudios no probaron suficientes concentraciones de DOX para generar curvas de exposición-respuesta y, en última instancia, no pudieron estimar ningún valor de IC50. Entre los estudios que informaron valores de IC50, se basaron en parámetros de batido. Por ejemplo, Richards et al. informaron un valor de IC50 para organoides cardíacos expuestos a DOX durante 48 h, medido a partir del cambio de área fraccional de los organoides durante el latido. Encontraron una IC50 de 0,41 µM, comparable a nuestros hallazgos.

Para mostrar la capacidad del OrganoidChip para permitir imágenes de mayor resolución, utilizamos microscopía confocal para varios organoides inmovilizados en el chip. Las imágenes representativas muestran una segmentación óptica mejorada y la capacidad de resolver células individuales dentro de un organoide (Fig. 4d). Los núcleos co-localizados teñidos con EthD-1 y Hoechst son resolubles y potencialmente pueden usarse para aumentar la precisión de las mediciones de viabilidad. La implementación futura de la segmentación 3D utilizando algoritmos asistidos por IA en el proceso de análisis puede proporcionar estimaciones más precisas de la viabilidad celular en pantallas más grandes.

A continuación, medimos el efecto del tratamiento con DOX sobre la cinética de latidos de los organoides cardíacos. Para ello, nos basamos en imágenes de fluorescencia de calcio, ya que se ha demostrado que es una buena aproximación de los potenciales de acción de los cardiomiocitos32. Las imágenes de calcio demostraron ser beneficiosas para los parámetros de latido y contracción, ya que las porciones de latido más pequeñas no necesariamente pueden detectarse en imágenes de campo claro, particularmente cuando los organoides se han visto comprometidos como resultado del tratamiento farmacológico.

Al evaluar los efectos de los fármacos, observamos cierto grado de variabilidad en el comportamiento contráctil espontáneo y la cinética de latidos entre los organoides cardíacos. Tal variabilidad a menudo distorsiona cualquier valor de parámetro promedio entre organoides y no refleja el efecto de las condiciones del tratamiento en la salud de los organoides. Para abordar este desafío, rastreamos el latido de cada organoide individual dentro y fuera del chip. Por lo tanto, los resultados de la funcionalidad inducida por el fármaco se informan como promedios de los cambios fraccionarios de los parámetros cinéticos de latido de cada organoide individual, medidos a las 48 h después del tratamiento, tanto en el portaobjetos de la cámara como en el chip, en relación con su valor previo al tratamiento (Ec. 3).

Al evaluar la cardiotoxicidad, estudiamos los parámetros cinéticos de latido bien informados, BR y ΔF/F0. Además, proponemos dos nuevos parámetros: el porcentaje de tiempo de batido (BT75) y la potencia de batido (FBT75) para evaluar aspectos menos comprendidos de la cinética de batido de organoides (ecuaciones 1 y 2). Al ajustar las curvas S a las respuestas dependientes de la dosis de los organoides, estimamos los niveles de IC50 de las condiciones dentro y fuera del chip para cada uno de estos parámetros (Fig. 5).

Curvas S dosis-respuesta de varios parámetros cinéticos de latido de organoides cardíacos en función de sus cambios fraccionarios (es decir, Δ (X)). Presentamos las curvas de los cambios fraccionarios para las tasas de batido dentro y fuera del chip (BR) (a), ΔF/F0 (b), el porcentaje de tiempo de batido (BT75) (c) y la potencia de batido (FBT75). (d). Ajustamos una curva en S a los datos y obtuvimos IC50 para las condiciones dentro y fuera del chip como se resume en los gráficos. Las curvas dentro y fuera del chip, así como las curvas de diferentes parámetros, se compararon bien entre sí sin diferencias estadísticamente significativas (prueba F). n ≥ 5 organoides por condición.

Curiosamente, todos los niveles de IC50 estimados a partir de los parámetros cinéticos medidos en el chip son casi idénticos a sus homólogos fuera del chip y a los informados en la literatura (Fig. 5 y Tabla complementaria S3)31. Además, los ajustes de la curva S fuera y dentro del chip no son estadísticamente diferentes (prueba F, Tabla complementaria S4). En conjunto, estos resultados indican que los niveles de toxicidad obtenidos de los análisis de golpes en el chip son similares a las mediciones fuera del chip, lo que demuestra aún más que OrganoidChip no introduce sesgos al evaluar la viabilidad o funcionalidad de los organoides. Además, las curvas dosis-respuesta estimadas en todos los parámetros de la cinética de latidos son similares entre sí (prueba F, Tabla complementaria S5). Además, sus valores de CI50 resultantes están dentro de los límites del error estándar de los valores de CI50 obtenidos del análisis de viabilidad (Tabla complementaria S3). Estos resultados indican que las imágenes de calcio se pueden usar indistintamente con imágenes de fluorescencia viva/muerta para obtener valores de IC50.

Desarrollamos un programa LabVIEW para controlar la cámara y nuestra platina de microscopio de campo amplio para obtener imágenes y movimientos del escenario rápidos y automatizados. El programa mueve el escenario a través de tres FOV en el chip, cada uno de los cuales contiene dos TA (correspondientes a dos organoides), para obtener imágenes de los seis TA con nuestra cámara de alta velocidad. Según la Tabla 1, logramos tiempos de obtención de imágenes de 10,4 y 70,0 s para imágenes transitorias de calcio dentro y fuera del chip y de 5,5 y 89,5 s para imágenes vivas y muertas dentro y fuera del chip de dos organoides cardíacos. La eliminación de los tiempos necesarios para encontrar un organoide en un pozo, el cambio al objetivo de NA alta y la localización de las regiones de interés y los planos focales correctos para las imágenes en el chip redujeron significativamente el tiempo de obtención de imágenes (Tabla 1). Las mediciones muestran que OrganoidChip es una herramienta prometedora para obtener imágenes rápidas con el fin de acelerar las evaluaciones de toxicidad de los medicamentos si se diseña con un mayor rendimiento, como se analiza más adelante en este manuscrito.

Faltan dispositivos que puedan proporcionar una inmovilización organoide sólida para obtener imágenes de alta resolución que puedan ampliarse a una configuración de alto rendimiento. Las imágenes de alto rendimiento y alta resolución requieren que los organoides estén completamente inmovilizados, lo que se puede lograr incrustando organoides dentro de hidrogeles. Sin embargo, el uso de hidrogeles tiene limitaciones, como distancias aleatorias de los organoides del objetivo. Para superar este desafío, Cambra et al. desarrollaron un sándwich de hidrogel de tres capas para el cultivo de organoides intestinales10. Utilizando placas estándar de 12 pocillos, los organoides se cultivaron en un rango estrecho de distancias desde el fondo de la placa. Otros idearon un método de inmovilización para organoides cerebrales incrustándolos en un hidrogel y restringiendo su altura entre un cubreobjetos y una membrana porosa11 o un inserto de placa impreso en 3D12. Estos métodos eliminan la deriva de organoides y, por lo tanto, permiten obtener imágenes de alta resolución y en intervalos de tiempo durante varios días. Sin embargo, también requieren una fabricación de dispositivos engorrosa y una carga de organoides y, lo que es más importante, no resuelven los problemas relacionados con la distribución de organoides en FOV aleatorios, lo que puede no ser propicio para formatos de alto rendimiento.

Alternativamente, los organoides se pueden cultivar sobre capas de PEG y Matrigel con micromodelos para producir estructuras similares a organoides inmovilizadas13. Aunque este método genera los organoides en un FOV fijo y es escalable a un cultivo de alto rendimiento, solo genera organoides tridimensionales parciales, que tienen una capacidad limitada para emular la estructura y función de los órganos14.

La incorporación de organoides con tecnologías de microfluidos ha creado plataformas útiles que pueden implementar tratamientos farmacológicos estándar15 con ensayos sofisticados16,17 para facilitar el seguimiento de muestras y el análisis de puntos finales mediante imágenes7,18. Aunque los dispositivos de microfluidos actuales pueden investigar muchos aspectos complejos de los organoides, muchos no son escalables a altos rendimientos debido a procesos engorrosos como el sellado o ensamblaje del chip después de la introducción de los organoides11,19,20, y a que tienen características de diseño que son difíciles de fabricar o no son propicios para métodos de fabricación rentables (por ejemplo, moldeo por inyección). Algunos dispositivos de microfluidos de última generación han logrado facilitar la inmovilización de organoides mediante hidrogeles17,20,21. A pesar de las extraordinarias capacidades de estos dispositivos, encontrar el campo de visión y el plano focal deseados, en la mayoría de ellos, sigue siendo un desafío para las imágenes de alta resolución. Aeby et al. abordó la dispersión aleatoria de organoides mediante la utilización de un cultivo de gotas colgantes de hidrogel dentro de un dispositivo de microfluidos que podría perfundirse durante más de nueve días21. Aunque el dispositivo realizó ensayos sobresalientes utilizando esferoides de colon e hígado, estos hidrogeles sólidos pueden no ser un lecho adecuado para estudiar ciertos tipos de organoides, como los organoides cardíacos que laten espontáneamente. Más importante aún, la adición y eliminación de tintes fluorescentes de los hidrogeles depende únicamente de la difusión del tinte, que puede ser un proceso relativamente lento regulado por la porosidad del hidrogel y la densidad de reticulación.

Incluso cuando está cargado con organoides, el OrganoidChip carece de materiales de hidrogel, lo que evita cualquier complicación previamente mencionada asociada con los métodos asistidos por hidrogel que conducen a pruebas más lentas y de menor escala. Para mejorar aún más la velocidad de obtención de imágenes e implementar imágenes de alto rendimiento, nuestro chip puede servir como bloque de construcción para diseñar una placa de 96 pocillos, en la que cada pocillo corresponde a un OrganoidChip, similar a la plataforma vivoChip de alto rendimiento que desarrollamos anteriormente33. . Especulamos que el tiempo ahorrado mediante el uso de dicho chip multipocillo de forma automatizada facilitará la detección a gran escala que se puede realizar en un corto período de tiempo. Nuestras estimaciones indican que la suma de los tiempos de obtención de imágenes para los transitorios de calcio y las imágenes vivas y muertas de 96 × 6 organoides es de 2 h frente a 25 h para la placa OrganoidChip de 96 pocillos hipotética frente a seis placas convencionales de 96 pocillos de fondo plano con un organoide por bien, respectivamente (ver Tabla complementaria S6). Se logró una reducción de un orden de magnitud en el tiempo al obtener imágenes de dos organoides a la vez en el chip y eliminar el tiempo asociado con la búsqueda de organoides dentro de un pozo o portaobjetos de cámara, la introducción y eliminación de tintes y la redeterminación de la posición de los organoides después de la incubación del tinte. Este tiempo ahorrado hace factible la detección de alto rendimiento para pruebas urgentes, como aplicaciones clínicas que involucran medicina personalizada, lo que demuestra que nuestra plataforma es una tecnología crucial y habilitadora para la comunidad de organoides y más allá.

Finalmente, enfatizamos que obtener imágenes de transitorios de calcio de organoides cardíacos que se contraen espontáneamente resulta un desafío ya que la región fluorescente de interés está sujeta a un movimiento significativo cuando se obtienen imágenes fuera del chip (video complementario S2). Se necesita mucho posprocesamiento para monitorear la misma región de interés utilizando métricas de correlación cruzada de la posición del organoide si el organoide todavía está dentro del campo de visión. Si el organoide se impulsa fuera del FOV, los datos transitorios de calcio comúnmente se pierden en los métodos de imágenes convencionales. Como prevemos el OrganoidChip como un componente básico para un dispositivo de mayor rendimiento, minimizar los pasos de posprocesamiento para tener en cuenta los movimientos de los organoides durante la obtención de imágenes en intervalos de tiempo demostrará ahorrar tiempo y potencia de procesamiento.

Desarrollamos un dispositivo de microfluidos, el OrganoidChip, que permite la inmovilización y tinción de organoides, todo en un solo dispositivo, para obtener imágenes rápidas y nítidas que minimizan la pérdida de muestras durante la administración del ensayo. Este dispositivo supera las limitaciones de las plataformas HCI existentes para imágenes de organoides y es compatible con microscopías confocales y de campo amplio de alta resolución. Demostramos estas capacidades únicas del OrganoidChip realizando HCI en organoides intestinales y cardíacos tratados con DOX para una evaluación de la toxicidad dependiente de la dosis.

El diseño único del OrganoidChip permite la inmovilización de organoides para evitar movimientos no deseados durante imágenes motorizadas rápidas, eliminando así el riesgo de que un organoide se salga del foco y del campo de visión. Las ubicaciones predeterminadas de las cámaras de inmovilización eliminan la engorrosa y lenta tarea de buscar en todo un pozo o plataforma de hidrogel para localizar organoides. Nuestro chip también es ventajoso para la obtención de imágenes volumétricas de organoides. Para organoides más grandes, la altura limitada de los TA permite obtener imágenes utilizando una menor cantidad de cortes z. Específicamente, las criptas y las estructuras de vellosidades inherentes a los organoides intestinales requieren muchas secciones ópticas para obtener una imagen completa de la morfología del organoide (Figura complementaria S6). Tomar menos imágenes reduce el tiempo requerido y minimiza el espacio de almacenamiento de datos.

Cargamos, inmovilizamos, teñimos y tomamos imágenes de organoides con éxito con el OrganoidChip y demostramos que estos procesos no afectan la viabilidad o funcionalidad de los organoides. Específicamente, estudiamos organoides cardíacos e intestinales que fueron expuestos a DOX, un fármaco quimioterapéutico estándar, durante 48 h de manera dosis dependiente. Se descubrió que los efectos de la toxicidad del DOX sobre la viabilidad de ambos tipos de organoides y la funcionalidad de los organoides cardíacos eran casi idénticos entre las pruebas dentro y fuera del chip. Los valores estimados de IC50 fueron similares a los datos publicados en la literatura, especialmente aquellos realizados mediante análisis basado en imágenes4,28. Estos estudios han utilizado microscopía de baja resolución (es decir, 4 × objetivo) para reducir la borrosidad de la imagen y eliminar exploraciones que requieren mucho tiempo para localizar organoides individuales dentro de un pozo para evaluar la viabilidad. Las imágenes de mayor resolución (es decir, ≥ 20 × imágenes confocales) podrían proporcionar una detección más precisa y sensible de los efectos citotóxicos inducidos por fármacos que se pueden implementar utilizando OrganoidChip.

Debido a la tendencia de los organoides a aglomerarse y la estocasticidad de la distribución de los organoides entre los TA, el proceso de carga necesita inclinación manual e inversión del flujo para lograr una alta eficiencia de captura. Aunque estas intervenciones manuales son factibles para estudios a pequeña escala, no son prácticas para estudios a gran escala que utilizan un chip multipocillo. Este desafío se puede abordar inclinando el chip de manera constante sobre un balancín automatizado durante el proceso de carga para promover una mejor distribución de organoides entre los TA. En caso contrario, también podemos diseñar el chip con un único TA por pocillo, en formato de placa de 384 pocillos, para eliminar la aglomeración de organoides ya que solo habrá un organoide por chip y, por tanto, el proceso de captura será determinista.

Las dimensiones de nuestro dispositivo están diseñadas para ser compatibles con métodos de fabricación rentables, como el estampado en caliente y el moldeo por inyección. Estas características se pueden replicar en un molde de estampado en caliente mediante transferencia elastomérica desde la oblea SU-8/Si. El tamaño mínimo de las características de los microcanales es del orden de ~ 0,1 mm para garantizar que las características del chip sean compatibles con el microfresado CNC, lo que lo convierte en un candidato ideal para ampliar la producción mediante moldeo por inyección en el futuro.

Las versiones futuras de OrganoidChip pueden incorporar pozos para cultivar organoides, específicamente organoides cardíacos, dentro del dispositivo de imágenes. La introducción automática de organoides en las áreas de captura reducirá significativamente los desafíos asociados con el pipeteo durante el proceso de transferencia de organoides33. Los organoides cultivados también se pueden limpiar ópticamente, fijar, inmunoteñir, visualizar en un chip y recuperar del chip para su posterior análisis.

En general, nuestros datos indican que OrganoidChip elimina muchas de las deficiencias de las tecnologías actuales para obtener imágenes de organoides. Además, la reciente Ley de modernización 2.0 de la FDA, que aprueba el uso de datos de organoides para la presentación de IND de nuevos fármacos en lugar de pruebas con animales in vivo, destaca el potencial del OrganoidChip en la evaluación preclínica de candidatos a fármacos terapéuticos.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores desean agradecer a los Institutos Nacionales de Salud (NIH) por el apoyo financiero con la subvención SBIR del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (NIEHS), R43-ES029890 que fue otorgada a vivoVerse, Inc. (anteriormente operando como Newormics , LLC).

Estos autores contribuyeron igualmente: Khashayar Moshksayan y Anirudha Harihara.

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Texas en Austin, Austin, TX, EE. UU.

Khashayar Moshksayan, Anirudha Harihara, Sudip Mondal, Evan Hegarty y Adela Ben-Yakar

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Texas en Austin, Austin, TX, EE. UU.

Janet Zoldán y Adela Ben-Yakar

Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad Estatal de Iowa, Ames, IA, EE. UU.

Todd Atherly, Dipak K. Sahoo, Albert E. Jergens y Karin Allenspach

Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad Estatal de Iowa, Ames, IA, EE. UU.

Jonathan P. Mochel

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KM, SM, EH y AB diseñaron el chip. KM optimizó el diseño y fabricó los chips. KM y AH realizaron los experimentos dentro y fuera del chip, prepararon los organoides intestinales y analizaron los datos. AH preparó los organoides cardíacos. TA, DKS, AJ, JPM y KA proporcionaron los cultivos de organoides intestinales. KM, AH, JZ y AB escribieron el borrador del manuscrito. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito final.

Correspondencia a Adela Ben-Yakar.

AJ, JPM y KA son cofundadores de 3D Health Solutions, Inc., una pequeña biotecnología que desarrolla ensayos basados ​​en organoides caninos para pruebas preclínicas de fármacos. AB, SM y EH son cofundadores de vivoVerse, Inc., una empresa de ciencias biológicas que proporciona instrumentos y servicios para pruebas toxicológicas con nuevas metodologías de enfoque (NAM).

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Reimpresiones y permisos

Moshksayan, K., Harihara, A., Mondal, S. et al. OrganoidChip facilita la inmovilización sin hidrogel para obtener imágenes rápidas y nítidas de organoides. Representante científico 13, 11268 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38212-8

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Recibido: 03 de mayo de 2023

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 12 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38212-8

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