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Oct 21, 2023

Muestreador de ADNe compacto y automatizado para el seguimiento in situ de entornos marinos

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5210 (2023) Cita este artículo 3147 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics El uso de ADN ambiental (eDNA) para monitorear la biodiversidad en ambientes acuáticos es

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 5210 (2023) Citar este artículo

3147 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

El uso de ADN ambiental (eDNA) para monitorear la biodiversidad en ambientes acuáticos se está convirtiendo en una alternativa eficiente y rentable a otros métodos como la identificación visual y acústica. Hasta hace poco, el muestreo de ADNe se lograba principalmente mediante métodos de muestreo manuales; sin embargo, con los avances tecnológicos, se están desarrollando muestreadores automatizados para hacer que el muestreo sea más fácil y accesible. Este artículo describe un nuevo muestreador de ADNe capaz de autolimpieza y captura y preservación de múltiples muestras, todo dentro de una sola unidad capaz de ser implementada por una sola persona. La primera prueba de campo de este muestreador se llevó a cabo en Bedford Basin, Nueva Escocia, Canadá, junto con muestras paralelas tomadas utilizando el método típico de recolección de botellas y filtración posterior a la recolección de Niskin. Ambos métodos pudieron capturar la misma comunidad microbiana acuática y los recuentos de secuencias de ADN representativas estaban bien correlacionados entre los métodos con valores de R\(^{2}\) que oscilaban entre 0,71 y 0,93. Los dos métodos de recolección arrojaron las mismas 10 familias principales en una abundancia relativa casi idéntica, lo que demuestra que el muestreador pudo capturar la misma composición comunitaria de microbios comunes que Niskin. El muestreador de ADNe presentado proporciona una alternativa sólida a los métodos de muestreo manuales, se adapta a las limitaciones de carga útil de los vehículos autónomos y facilitará el monitoreo persistente de sitios remotos e inaccesibles.

El aumento de la actividad humana en ambientes acuáticos ha generado preocupación sobre los efectos antropogénicos que causan problemas como la hipoxia, la acidificación de los océanos y la eutrofización causada por una mayor carga de nutrientes1. Estos impactos pueden impedir el crecimiento de ciertos organismos, como las especies marinas calcificantes, cuyos caparazones y esqueletos pueden verse afectados por la acidificación2 y promover el crecimiento de otras especies, incluidas aquellas que causan floraciones de algas nocivas (FAN) que dañan a los peces y a la economía humana3. 4. La escala de tiempo de estos cambios y sus impactos consiguientes puede variar desde horas hasta años, y dado que cada ecosistema es único, los cambios pueden ser difíciles de rastrear, lo que requiere observaciones in situ resueltas en el tiempo para evaluar adecuadamente los cambios.

Los programas de seguimiento biológico se han centrado tradicionalmente en la identificación manual de grupos taxonómicos clave de interés; sin embargo, estos programas pueden llevar mucho tiempo y requerir capacitación especial en identificación taxonómica. En los últimos años, con una disminución en el costo de la secuenciación del ADN y el tamaño cada vez mayor de las bases de datos de ácidos nucleicos, el ADN ambiental (eDNA) se utiliza cada vez más como indicador de la biodiversidad en los programas de monitoreo biológico5. La monitorización del eDNA implica estudiar todo el ADN presente en el medio ambiente6 y es ventajoso de múltiples maneras, ya que no es invasivo y ampliamente aplicable tanto a la microbiota como a los metazoos utilizando un conjunto de métodos analíticos en rápida evolución, desde la extracción sensible de ADN hasta la detección de secuencias de códigos de barras únicas7. Existen numerosos estudios que han demostrado el valor del eDNA para estudiar la diversidad microbiana, dada la importancia de su papel en la producción primaria por fitoplancton y el ciclo biogeoquímico de la materia orgánica muerta. Por ejemplo, el biomonitoreo de la microbiota en entornos de acuicultura ha demostrado la utilidad del ADNe para detectar la rápida respuesta microbiana a las perturbaciones ambientales y evaluar estrategias de gestión para una industria acuícola sostenible8,9,10. Además, un número cada vez mayor de estudios ha demostrado el importante papel que el eDNA está destinado a desempeñar en el seguimiento ambiental de la biodiversidad de peces11, el seguimiento de mamíferos marinos12 y otros aspectos de la biología de la conservación13.

Los métodos actuales para el muestreo de ADNe suelen requerir mucha mano de obra e implican la recolección de muestras utilizando botellas Niskin o equipos similares, seguidas de pasos separados de filtración y conservación, a menudo utilizando una bomba peristáltica y un congelador, respectivamente. Los componentes manuales del muestreo y análisis de eDNA limitan su uso en entornos remotos o en entornos donde se deben tomar muestras con regularidad y requieren una persona capacitada para realizar el proceso. Ampliar la aplicabilidad de los métodos de ADNe a problemas más desafiantes requiere automatización, incluido el desarrollo de equipos de muestreo automatizados. Los muestreadores desarrollados recientemente van desde sistemas de un solo filtro hasta sistemas de múltiples filtros más complejos, y cada uno varía en parámetros como la duración del despliegue, la clasificación de profundidad máxima y los productos químicos/conservantes utilizados. En la Tabla 1 se describe una lista representativa de los muestreadores de ADNe actuales, tanto disponibles comercialmente como prototipos de investigación.

Comenzando por el más avanzado, el procesador de muestras ambientales (ESP) alberga la impresionante cantidad de 60 cartuchos de filtro; sin embargo, los muestreadores ESP se han mantenido principalmente en estudios de investigación sin realizar una transición completa a flujos de trabajo y aplicaciones comerciales, como el uso por parte de operadores de acuicultura, implementación en puertos urbanos, instalaciones de turbinas eólicas, etc. Este muestreador se basa en una evolución del pionero ESP, un muestreador in situ y un analizador de ADN desarrollado por el Instituto de Investigación del Acuario de la Bahía de Monterey (MBARI). Estos analizadores totalmente sumergibles se desarrollaron entre 2001 y 200924 y se denominaron Generación 1 y Generación 2. Eran laboratorios submarinos integrales que realizaban recolección de muestras y extracción de ADN para alimentar dispositivos de microfluidos de PCR, matrices de hibridación y ensayos tipo sándwich. Sin embargo, los instrumentos ESP Generación 1 y Generación 2 cuestan varios cientos de miles de dólares y son muy complejos de implementar y mantener, con contratos finales que generalmente ascienden a millones de dólares. La última generación de instrumentación de MBARI, Generación 3, eliminó por completo el análisis integrado, con el objetivo de realizar la recolección de muestras con preservación en vehículos submarinos, seguido de análisis genómicos en laboratorios terrestres20.

Aunque el costo y la complejidad se redujeron para el ESP Generación 3, los muestreadores nuevos y optimizados apuntaron a mejorar aún más la escalabilidad para recolectar eDNA in situ, incluyendo: el Subsurface Automated Sampler for eDNA (SASe), PolyWAG (Water Acquired Genomics) y CLAM. (Monitoreo Acuático Continuo de Bajo Nivel). Estos sistemas tienen un precio de miles de dólares, lo que hace que el muestreo automatizado de ADNe sea más accesible. La mayoría de estos muestreadores optimizados tienen un solo filtro, no suelen llevar reactivos de conservación o limpieza y son adecuados para implementaciones a corto plazo (por hora, por día). Si bien algunos tienen capacidad de implementación a largo plazo (la unidad SASe tiene capacidad de preservación incorporada), muchos carecen de la capacidad de autolimpiarse con ácidos o lejía, ni limpian la entrada/entrada de muestra para minimizar la bioincrustación y la contaminación cruzada. El sistema polyWAG ofrece 24 filtros con autolimpieza integrada mediante aire y autoconservación mediante etanol. La automatización adicional aumenta el costo a 3000-5000 USD. Además, estos diseños rara vez consideran factores de forma que sean susceptibles de integración con plataformas o restricciones de carga útil de vehículos autónomos, en algunos casos con tuberías expuestas y cables y componentes electrónicos sueltos.

(a) Representación CAD en 3D del muestreador DOT eDNA con una sección electrónica parcialmente expuesta. (b) Vista transversal del muestreador de ADNe DOT, destacando todos los compartimentos, las bolsas de almacenamiento de líquidos y el fluorómetro adjunto. (c) Muestreador de ADNe DOT completamente construido desplegado bajo el agua.

Aquí presentamos un novedoso muestreador de ADNe autónomo capaz de recolectar, filtrar y preservar una muestra de agua utilizando un diseño innovador, todo dentro de un solo instrumento, como se muestra en la Figura 1. El muestreador puede recolectar hasta 9 muestras discretas por implementación, lo que, a diferencia de otros muestreadores, se almacenan en un casete extraíble que se puede cambiar fácilmente in situ en menos de 5 minutos. Esto permite la reubicación inmediata del instrumento, donde se puede cargar rápidamente un nuevo casete y el casete lleno se analiza en el campo o en el laboratorio. Además, la unidad es autolimpiante para evitar la bioincrustación y todos los tubos están contenidos en la carcasa del instrumento para evitar que se enganchen en las líneas durante los despliegues. El muestreador también es compacto y está diseñado con asas dobles, lo que permite que una sola persona pueda transportarlo y desplegarlo. El muestreador está disponible comercialmente para su compra a través de Dartmouth Ocean Technologies Inc., Canadá. El precio de mercado inicial del muestreador de ADNe es de 55 000 USD por el instrumento y de 5000 a 10 000 USD en reactivos, opciones y casetes de filtro adicionales. Aquí describimos la prueba inicial del muestreador en un despliegue en el mundo real frente a una embarcación pequeña. El diseño del muestreador centrado en el usuario permite la estandarización y simplificación de la recolección de ADNe, mejorando así la confiabilidad y repetibilidad del muestreo para el monitoreo ambiental. Nuestro muestreador pudo igualar los resultados obtenidos mediante el uso de los métodos típicos de captura de botellas y filtración peristáltica de Niskin desde un nivel de comunidad microbiana hasta el nivel de secuencia individual.

La Universidad de Dalhousie ha colaborado con Dartmouth Ocean Technologies, Inc. (DOT) para crear un novedoso muestreador de ADNe que presenta un enfoque modular simple que tiene tres secciones desmontables: cartucho de filtro, sección electrónica y sección de almacenamiento de fluidos, como se muestra en la Fig. 1. La unidad completamente ensamblada tiene una longitud de 72,1 cm y una anchura de 16,8 cm, y pesa 11,3 kg en aire y 3,3 kg en agua salada. Es capaz de limpiar entre capturas de muestras, preservar las muestras capturadas y tiene 9 filtros discretos, cada uno de 25 mm de diámetro. Se pueden cargar diferentes membranas de filtro en los portafiltros (Advantec 43303010, polipropileno), lo que permite utilizar una amplia variedad de materiales de membrana y tamaños de poro según las especies específicas. El cartucho de filtro del muestreador de eDNA está hecho de material polieteretercetona (PEEK) y contiene los 9 portafiltros. Una vez que el cartucho de filtro esté cargado con filtros limpios, se puede conectar a la sección electrónica del muestreador de eDNA. Este enfoque de intercambio rápido permite preparar múltiples cartuchos de filtro y luego cargarlos en el muestreador según sea necesario. El cartucho filtrante está asegurado por 3 perillas que están indexadas a la sección electrónica para evitar errores de montaje. La versión del muestreador utilizada en este artículo tiene una profundidad nominal de 20 m. Sin embargo, hay disponible una versión de 3000 m y se ha probado con éxito en una cámara de presión en los laboratorios de ESL (Dartmouth, NS, Canadá).

La sección electrónica del eDNA sampler es el núcleo del instrumento. Alberga una bomba y un árbol de válvulas personalizado, junto con una placa de circuito impreso (PCB) personalizada para automatización y registro de datos. La PCB y el software se describirán en la sección Arquitectura del sistema a continuación. El árbol de válvulas consta del colector de recorrido de fluido, un sensor de presión, interconexiones de tubos y válvulas de solenoide para el muestreador. El árbol de válvulas también tiene puertos que se utilizan para acoplarse de manera fluida a los filtros en el cartucho de filtro y para acceder a las bolsas de fluido cargadas con reactivos y almacenadas en la sección de fluido del muestreador.

La sección de almacenamiento de fluidos del muestreador de eDNA alberga y protege todos los fluidos necesarios y un fluorómetro opcional. Los fluidos almacenados en esta sección son los siguientes: ácido clorhídrico (HCl) al 5% (limpieza), RNAlater (conservación), agua purificada Milli-Q (enjuague) y residuos. Los fluidos se almacenan en contenedores de bioprocesos (BPC) Labtainer\(^{\textrm{TM}}\) Labtainer\(^{\textrm{TM}}\) de 100 y 500 ml y se conectan a la sección de electrónica con puertos de 1/4 a 28. La bolsa de residuos se utiliza para contener productos químicos que no se considera seguro arrojar al océano o a las aguas circundantes. RNAlater se usa para preservar las muestras recolectadas, HCl al 5% se usa para limpiar las líneas de fluido del sistema y hacer retroceder la entrada de la muestra, y Milli-Q se usa para lavar el sistema entre los pasos del protocolo. El HCl al 5 % y Milli-Q son eficaces para reducir la contaminación cruzada que podría tener lugar en los tubos y colectores del sistema entre eventos de muestreo. El HCl y el RNAlater utilizados en este estudio fueron de grado analítico y fueron suministrados por Fisher Chemical (Waltham, MA, EE. UU.).

El esquema de fluido del muestreador de eDNA se ilustra en la Fig. 2. El muestreador de eDNA presenta varias válvulas solenoides, membranas de filtro, productos químicos integrados y acceso a los fluidos circundantes a través de los puertos de entrada y salida de la muestra. El muestreador de eDNA presenta scripts de control personalizados que se utilizan para coordinar las operaciones entre las válvulas solenoides y la bomba de jeringa. Esta coordinación permite que el fluido se mueva de una ubicación del muestreador a otra. El movimiento del fluido se realiza simultáneamente con el monitoreo y registro de las lecturas del fluorómetro y de la presión. Los scripts personalizados pueden programarse en la memoria flash del muestreador de eDNA, o en el almacenamiento de la tarjeta SD, o ingresarse manualmente a través de una terminal para un mayor control. El script que se utilizó para este artículo se ingresó manualmente a través del terminal para brindarle al usuario mayor control y visibilidad de depuración debido a que era la primera vez que se implementaba el muestreador. El script personalizado contiene el protocolo de muestreo que establece lo siguiente: número de válvulas activas, volumen de recolección, límite de tiempo y caudal mínimo para cada uno de sus pasos.

Esquema de fluidos para el muestreador de ADNe DOT. Se utilizan nueve filtros para la recolección programada de muestras filtrando de 15 ml a 10 litros o más de agua, según la carga de partículas de la muestra. Se utiliza un sensor de presión en línea para monitorear la presión transmembrana y detectar la acumulación de material en la membrana del filtro. RNAlater, 5 % HCL y agua Milli-Q tienen rutas de enrutamiento que se utilizan para la conservación y la limpieza.

(a) Protocolo utilizado para capturar y conservar la muestra y luego limpiar los canales de fluido. (b) Diagrama de flujo de umbrales utilizado para cargar y ejecutar protocolos dentro de una región operativa segura especificada por el usuario (F - Caudal, P - Presión, T - Tiempo, V - Volumen). (c) Datos de presión capturados durante el proceso de muestreo en una membrana de filtro de policarbonato de 0,22 \(\upmu\) m. * El tiempo de muestreo depende del caudal especificado en el protocolo y de la turbidez del fluido. El tiempo mostrado arriba es de 20 ml/min en condiciones ideales.

El protocolo de muestreo utilizado para la implementación descrita en este artículo se muestra en la Fig. 3a. Debajo de cada paso, se muestra el tiempo estimado de finalización. El paso "Sample Prime" comienza el protocolo de muestreo y prepara el muestreador lavando sus canales internos con el fluido de muestra previsto. A partir de entonces, el muestreador ya está listo para realizar el paso "Captura de muestra". Este paso empuja el fluido de muestra a través de la membrana de filtro seleccionada (M1 a M9) para la captura de la muestra. Para preservar el material recolectado en el filtro, el paso "Conservación de RNAlater" empuja el RNAlater a través de la membrana del filtro seleccionado. Luego, el paso "MQ Flush" utiliza Milli-Q para eliminar RNAlater del sistema y evitar que entre en contacto con el HCl al 5 % que se utiliza en el siguiente paso. El paso “Limpieza ácida” limpia los canales de fluidos internos del muestreador de contaminantes mediante el uso de HCl al 5%. A continuación, el paso "MQ Flush" elimina el HCl al 5 % de los canales utilizando Milli-Q. Este proceso limpia el muestreador y lo prepara para la siguiente captura de muestra. Existe la posibilidad de que quede ácido residual cerca de la entrada de la muestra después de hacer retroceder la entrada de la muestra con ácido. Sin embargo, después del retrolavado de ácido, el protocolo predeterminado también empuja 9 ml de Milli-Q a través de la entrada de muestra para lavar las líneas y la entrada de ácido. Esto alejará el HCl al 5% diluido de la entrada de la muestra y permitirá que el flujo convectivo elimine el ácido localizado antes del siguiente evento de muestreo. En esta implementación, el lavado de ácido se realizó al final de un evento de muestra y se utilizó un mínimo de 30 minutos entre muestras sucesivas. En el futuro, se podría agregar un período de espera mínimo al protocolo para aguas estancadas o de bajo flujo para evitar un falso negativo, donde el HCL digeriría la muestra en el ambiente antes de la captura.

El algoritmo que se muestra en la Fig. 3b se ejecuta cada vez que se activa la captura de muestra. Este algoritmo ejecuta los pasos que se muestran en el protocolo de muestreo y monitorea el volumen, la presión y el tiempo para garantizar que el muestreador se mantenga dentro de unas condiciones de funcionamiento tolerables. El algoritmo comienza ejecutando una serie de comprobaciones. La primera verificación es determinar que la presión dentro del sistema no exceda un límite de presión preestablecido. Si la presión es mayor que ese límite, el sistema reduce el caudal en un 40% preestablecido. Después de esto, el sistema verifica el caudal, el tiempo transcurrido y el volumen desde el inicio del paso del protocolo. Si se excede alguno de los límites, el muestreador pasa al siguiente paso del script. Luego, este procedimiento se repite hasta que no quedan pasos en el protocolo de muestreo. Luego, el muestreador entra en un estado de bajo consumo y espera una interrupción para activar el protocolo de muestreo una vez más. La Figura 3c ilustra el perfil de presión de una implementación reciente de un muestreador de ADNe en el que se realizó el protocolo de muestreo que se muestra en la Figura 3a.

El muestreador es autónomo ya que puede realizar todas las funcionalidades después de ser programado con un cronograma de muestra sin necesidad de interacción humana o del usuario. Las funcionalidades incluyen captura de muestras, autolimpieza y conservación de muestras. La única interacción humana es cambiar el cartucho del filtro, los productos químicos y la batería, además de programar el programador. Más allá de la activación programada, el muestreador de eDNA contiene un procesador integrado de 32 bits que permite activarlo desde sensores y computadoras externos (por ejemplo, sistemas de asiento trasero AUV).

La arquitectura del sistema del muestreador de ADNe se muestra en la Fig. 4a. La Figura 4b muestra una PCB completamente construida para el muestreador de eDNA. Debido a los variados requisitos eléctricos de los subcomponentes, el sistema cuenta con reguladores para generar múltiples voltajes que van desde 3,3 a 12 VCC, todos alimentados por una batería o una entrada de fuente de alimentación de 7 a 24 VCC. El amplio rango de entrada de voltaje permite flexibilidad en las plataformas utilizadas para el despliegue (UAV/USV, boyas, amarres, etc.). El sistema se controla mediante un microcontrolador ARM Cortex M4 (STM32F411) que funciona a 84 MHz y está configurado como un sistema en tiempo real (RTS) que se rige por varias interrupciones y controles de bajo nivel para garantizar una sincronización precisa. Un único microcontrolador gestiona la bomba de jeringa, el registro de datos, la comunicación y la ejecución del protocolo. La bomba de jeringa (una variante personalizada tolerante a los ácidos del LPDA1750330H, Lee Company Ltd.) se alimenta con un circuito controlador de motor paso a paso (DRV8834, Texas Instruments) junto con un codificador de cuadratura óptica para ayudar al seguimiento preciso del volumen utilizado. Las 26 válvulas solenoides utilizadas por el sistema son accionadas por un circuito de punta y retención (DRV8860, Texas Instruments) que permite alimentar 32 válvulas sin una carga de corriente excesiva. El DRV8860 es un dispositivo conectable en serie y permite un diseño modular para la expansión de solenoides que puede utilizar el sistema. El muestreador de eDNA utiliza un módulo ADC de 16 bits (ADS1115, Texas Instruments) que puede leer el sensor de presión en una configuración de puente de Wheatstone con su amplificador de ganancia programable (PGA) incorporado. La señal amplificada permite leer las mediciones de presión diferencial transmembrana para garantizar que las membranas se utilicen dentro de las especificaciones del fabricante (normalmente menos de 4 bar, 60 psi). Se puede agregar un sensor de presión opcional para leer la presión ambiental del medio ambiente y la profundidad del muestreador. El muestreador almacena todos los datos en una tarjeta microSD interna de 32 GB con archivos y carpetas con marca de tiempo. Los usuarios interactúan con el muestreador de eDNA a través de Bluetooth (a través de una aplicación de teléfono inteligente) y/o a través de RS-232 y un terminal de computadora personal. Ambos permiten enviar comandos operativos al muestreador y también son conductos para transferir datos hacia/desde el sistema; por ejemplo, establecer tiempos de muestreo programados a través del reloj de tiempo real (RTC) y/o recuperar datos de presión y fluorómetro por membrana/muestra. En reposo, el sistema consume 1 W, mientras que en el muestreo consume 10 W máximo.

(a) Diagrama de arquitectura para el muestreador DOT eDNA que muestra conexiones y componentes eléctricos internos junto con interfaces al mundo externo, basado en el microprocesador STM32F411. (b) Vista frontal de la PCB diseñada con componentes de montaje en superficie.

El muestreador de eDNA fue alimentado por una batería para la implementación descrita en este trabajo. El paquete de baterías único, cloruro de tionilo de litio de 561,6 Wh, duró todo el período de implementación. La batería puede soportar un máximo de 33,7 L de bombeo, suponiendo que no haya bloqueo de las membranas, lo que debería ser suficiente para 32 capturas de filtro a 1 L por captura y un caudal promedio de 10 ml/min. Los litros bombeados son la métrica más apropiada para establecer las expectativas de duración de la batería, ya que la bomba consume la mayor cantidad de electricidad en el muestreador de eDNA (8 W, 80 % del presupuesto de energía en el pico). Estas suposiciones también dependen de la turbidez/carga de partículas del agua durante el muestreo. Más allá del consumo de batería o energía, los fluidos son actualmente el factor limitante para el uso continuo, ya que los depósitos de reactivos estándar son buenos para 1 cartucho de filtro (9 capturas de filtro), con planes para tener una versión con capacidad de fluido mejorada que admita 3 cartuchos de filtro (27 capturas de filtro). capturas).

Si bien no necesitábamos una fuente de alimentación externa para esta demostración, el muestreador de eDNA también se puede alimentar con una fuente de alimentación típica de 7 a 24 V CC. La alimentación se proporciona a través de un cable Subconn de 6 pines y puede ser suministrada por un vehículo o plataforma. Dado el bajo consumo de energía del muestreador de eDNA (pico de 10 W), el muestreador es altamente adaptable a la carga del hotel disponible en la mayoría de los vehículos autónomos y también en boyas o instalaciones alimentadas por energía solar.

Como primera prueba de cómo funciona este muestreador de ADNe in situ, el muestreador se implementó durante un transecto del puerto de Halifax hacia la cuenca de Bedford, como se muestra en la Fig. 5. El muestreo se realizó a lo largo de una serie de estaciones para este transecto en la cuenca de Bedford. , donde cada estación fue muestreada una vez. En cada estación, la unidad se desplegó a 5 m de profundidad y se ejecutó la primera parte del guión, donde se filtró una sola muestra de 125 ml de agua a través de un policarbonato (PC) de 25 mm de diámetro y 0,22 \(\upmu\)m. membrana (Millipore). El muestreador se desplegó durante todo el tiempo que el barco estuvo en la estación (15 a 17 minutos), asegurando que se capturaran los 125 ml completos. Después de volver a colocar el muestreador en la cubierta, se ejecutó la segunda parte del guión, donde se bombearon 6 ml de RNAlater a través de la membrana para su conservación y se realizó el paso de "Limpieza con ácido". Debido a las limitaciones de tiempo para el mantenimiento de la estación, se implementó este enfoque de dos pasos; sin embargo, ambos pasos son fáciles de combinar cuando el muestreador se implementa según lo previsto y sin intervención humana. Las muestras se almacenaron en RNAlater en el casete durante la noche, después de lo cual ellas y el prefiltro de 35 \(\upmu\)m se retiraron y se almacenaron por un corto plazo en un congelador de -20 \(^{\circ }\)C, luego más largo plazo en un congelador de −80 \(^{\circ }\)C antes de extraer el ADN. Aunque el muestreador conserva las muestras con RNAlater automáticamente, los filtros se congelaron según lo recomendado para el almacenamiento a largo plazo debido al cronograma desconocido entre el transecto y la extracción de ADN. Para esta implementación, el muestreador incluyó un prefiltro de 35 \(\upmu\)m en la entrada. Este filtro de entrada se agregó porque en la configuración actual, las válvulas no están clasificadas para partículas de más de 35 \(\upmu\)m. El prefiltro puede limitar el muestreador a aplicaciones que estudian microorganismos con tamaños de células inferiores a 35 \(\upmu\)m. Actualmente estamos investigando el rendimiento del sistema con un prefiltro más grande de 100 \(\upmu\)m.

Mapa de lugares de muestreo del puerto de Halifax. Las estaciones están numeradas en orden secuencial, siendo S1 la primera y S6 la última. Las muestras en S3 y S4 se tomaron en el mismo lugar con aproximadamente 2 horas de diferencia. Los gráficos de barras apiladas resaltan las 10 familias taxonómicas de bacterias relativamente abundantes en cada estación de muestreo para todas las muestras. Todos los ASV que no se encuentran entre las 10 familias principales se representan como "Otros". El mapa presentado aquí fue creado en RStudio36 utilizando datos GADM (Versión 3.6)48 y los paquetes R ggplot239 y ggsn49.

Mapa de lugares de muestreo del puerto de Halifax. Las estaciones están numeradas en orden secuencial, siendo S1 la primera y S6 la última. Las muestras en S3 y S4 se tomaron en el mismo lugar con aproximadamente 2 horas de diferencia. Se crearon gráficos de barras apiladas identificando los 10 ASV de ARNr 16S de cloroplasto relativamente abundantes en cada muestra. Los ASV se identifican hasta el rango taxonómico más bajo posible, y los ASV con la misma taxonomía se distinguen además como “ASV 1” a “ASV 3”. El primer ASV de la leyenda, etiquetado como “Cyanobacteria ASV 1”, es el único ASV que también se recuperó del prefiltro. El mapa presentado aquí fue creado en RStudio36 utilizando datos GADM (Versión 3.6)48 y los paquetes R ggplot239 y ggsn49.

Se tomaron muestras de botellas paralelas al mismo tiempo y profundidad en cada estación utilizando una botella Niskin de 5 L atada a una cuerda. En cada estación se desplegó el Niskin para capturar una muestra de agua directamente al lado del muestreador. Luego, esta muestra de agua se dividió en dos botellas, que se filtraron en cubierta utilizando una bomba peristáltica a través de membranas de PC de 47 mm de diámetro y 0,22 \(\upmu\)m (Millipore), lo que dio como resultado filtros duplicados de cada implementación de Niskin. Se filtraron entre 660 y 1140 ml de agua para cada duplicado, después de lo cual se registró el volumen filtrado y las membranas se congelaron inmediatamente en un criotransportador cebado con nitrógeno líquido.

Se extrajo y procesó el ADN de todos los filtros del muestreador y un duplicado de Niskin de cada estación. Las otras muestras de Niskin se archivaron y conservaron a −80 \(^{\circ }\)C como copia de seguridad en caso de que hubiera problemas con la extracción o la secuenciación. Se utilizó el mini kit de plantas Qiagen DNeasy para extraer ADN de todas las muestras utilizando un protocolo modificado basado en Zorz et al.25 con las siguientes modificaciones adicionales: las muestras se incubaron a 52 \(^{\circ }\)C durante 1 hora y Se usaron los mismos 50 \(\upmu\)l de tampón de elución de Qiagen (tampón AE) para eluir el ADN dos veces para garantizar que se extrajeran las concentraciones máximas de ADN. Después de la extracción, se enviaron 10 \(\upmu\)l de ADN de cada muestra para la secuenciación de Illumina en el Laboratorio Integrado de Recursos de Microbioma (IMR) de la Universidad de Dalhousie. Se secuenció el ADN para la región V4-V5 del gen del ARN ribosómico 16S según el procedimiento operativo estándar de IMR para la secuenciación de amplicones, como se describe en Comeau et al.26. Los fragmentos del amplicón 16S se amplificaron por duplicado utilizando una sola ronda de PCR usando cebadores de fusión (adaptadores Illumina + índices + regiones específicas) 515F = 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′ y 926R = 5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′27,28.

Las secuencias se procesaron de acuerdo con Microbiome Helper desarrollado por IMR26 utilizando QIIME2 2019.729. Se utilizó Deblur (complemento QIIME2 versión 2019.7)30 para eliminar el ruido de las secuencias, así como para identificar y etiquetar variantes de secuencias de amplicones (ASV) individuales31. Los ASV son grupos de secuencias de ADN altamente relacionadas que se tratan como una única unidad homogénea; cada uno se asigna a un grupo taxonómico particular, como una especie, y varios ASV potencialmente se asignan al mismo grupo. Después de la identificación, los ASV se clasificaron utilizando la base de datos SILVA 13232,33, así como la base de datos PhytoREF34 para una mayor clasificación de las secuencias de cloroplastos. Se crearon dos tablas de ASV a partir de estos datos: una con los recuentos de ASV sin procesar y una segunda donde los recuentos de ASV sin procesar se redujeron a 4000 para poder comparar la abundancia relativa entre muestras. La rarefacción es un proceso de normalización mediante el cual se submuestrean muestras de diferentes tamaños hasta un umbral normalizado35. Las curvas de rarefacción en la Fig. S2 se pueden encontrar en la información de respaldo. Todos los gráficos se realizaron utilizando RStudio36 utilizando los siguientes paquetes: UpSetR37, Phyloseq38, ggplot239 y ggpmisc40.

En total, se tomaron muestras de 6 estaciones en el primer despliegue de campo del muestreador de ADNe; las coordenadas y el momento en que se tomaron las muestras se pueden encontrar en la Tabla S1. El mapa de las estaciones muestreadas se muestra en la Fig. 5. En 2 de las 6 estaciones, S2 y S6, no se alcanzó el volumen objetivo preestablecido. Esto se debió a que la presión transmembrana alcanzó el umbral, con suficiente material acumulado para bloquear la membrana del filtro, por lo que el umbral de tiempo de permanencia en la estación se cumplió antes que el umbral de volumen. Las estaciones restantes, S1, S3, S4 y S5 capturaron el 100% de la muestra, como se muestra en la Tabla 2. La Tabla 2 describe varias métricas con respecto al ADN extraído y los datos de secuenciación sin procesar para cada muestra de transecto y el prefiltro. Aunque las concentraciones de ADN eluido fueron menores en las muestras recolectadas con el muestreador, al considerar la diferencia en el volumen filtrado, la concentración de ADN de la fuente original (es decir, agua de mar) es comparable entre el Niskin y el muestreador, pero no es idéntica, ya que las extracciones de ADN no son 100 % eficientes. . Además, el prefiltro tenía una concentración de ADN eluido más baja y casi 0 ng/ml en la muestra original.

La Figura 5 muestra las 10 familias con la mayor abundancia relativa en cada estación para ambos métodos de recolección, también mostradas una al lado de la otra en la Fig. S1. Los dos métodos de recolección arrojaron las mismas familias principales en una abundancia relativa casi idéntica, lo que demuestra que el muestreador pudo capturar la misma composición comunitaria de microbios comunes que Niskin. Las 10 familias más abundantes se encontraron en las 12 muestras, teniendo Rhodobacteraceae la mayor diferencia en abundancia relativa entre Niskin y el muestreador en 5 de 6 estaciones (9% en S1, 5% en S3-S6) y Flavobacteraceae teniendo la mayor diferencia en S2 (6%). La diferencia entre todos los demás taxones en cada estación fue inferior al 5% con excepción de Burkholderiaceae. La familia Burkholderiaceae mostró una alta variación en el sitio S1 (muestreador: 10%, Niskin: 2%) y en menor medida S2 (muestreador: 4%, Niskin: 2%). Esto se debió a un ASV particular clasificado como Ralstonia picketti, que se encontró en todas las muestras del muestreador, pero en ninguna de las muestras de Niskin. Un análisis similar de la comunidad de fitoplancton en la Fig. 6 muestra una fuerte floración de Thalassiosirales que se presentó como un ASV de cloroplasto único que domina ambos tipos de muestra (Niskin y muestreador) en todas las estaciones, desde el 30% de todas las lecturas de cloroplasto en S4 Niskin hasta el 60%. % en S3 Niskin. No se encontró evidencia de Thalassiosirales en la muestra del prefiltro y el único ASV encontrado en el prefiltro (representado como cianobacteria en la Fig. 6) se encontró en baja abundancia relativa en el resto de las muestras.

Diagramas de dispersión que muestran recuentos brutos de todos los ASV en muestras de cada método de recolección comparados entre sí. El único punto rojo indica los recuentos brutos de Ralstonia picketti, un contaminante potencial que se encuentra sólo en el muestreador. El contaminante disminuye con una mayor utilización del muestreador, de S1 a S6, lo que indica que las nuevas construcciones de muestreadores deben limpiarse a fondo después del ensamblaje para eliminar los contaminantes.

Los resultados de los muestreadores de Niskin y eDNA también fueron cuantitativamente similares a nivel de ASV individuales. La Figura 7 muestra la correlación entre los ASV de muestreo y los ASV de Niskin (tanto bacterianos como de fitoplancton) en cada sitio. Los valores de R\(^{2}\) oscilaron entre 0,71 y 0,93, y las estaciones posteriores tuvieron valores de R\(^{2}\) más altos que las estaciones S1 y S2. La Ralstonia picketti ASV mencionada anteriormente está resaltada en rojo y tiene recuentos más altos en S1 y S2 (7,5% y 2% del total de recuentos respectivamente), con menor abundancia en las estaciones S3–S6 (\(\le\) 1% del total cuenta). La Figura S3 muestra un diagrama de dispersión de los recuentos combinados de cada ASV en las estaciones 1 a 6 para cada método.

Gráfico alterado de ASV en cada muestra, así como el prefiltro (PF). Cada columna muestra el recuento de ASV con el patrón de aparición indicado por los puntos negros con las muestras asociadas. El número total de ASV asociados con cada muestra se muestra a la izquierda. Aquí se muestran conjuntos de muestras con 3 o más ASV asociados, y no se muestran las combinaciones de muestras que devuelven ASV que ocurren solo una o dos veces.

Por último, examinamos los patrones de presencia y ausencia de cada ASV en las 13 muestras de muestreador, Niskin y prefiltro. El patrón de presencia/ausencia más común incluyó 190 ASV que se encontraron sólo en la muestra previa al filtro (Fig. 8); sin embargo, estos representan menos del 10% (20.936 de 235.501 secuencias recopiladas de todas las muestras). Por el contrario, sólo se encontraron 65 ASV en el prefiltro y al menos otra muestra. Esto refuerza aún más el hecho de que el prefiltro no filtró ningún ASV importante en la columna de agua, sino que tenía su propia composición. Se encontraron un total de 124 ASV en los doce sitios de muestra de Bedford Basin, 24 de los cuales también se recuperaron del prefiltro. De estos, los 100 ASV recuperados solo de los sitios de Bedford Basin representaron 171.345 secuencias (72,8%), mientras que los 24 ASV recuperados de todas las muestras representaron 23.341 secuencias (10,0% de todas las secuencias recuperadas). Más de siete ASV no exhibieron ningún otro patrón de presencia/ausencia, y la mayoría de los patrones se observaron una o dos veces en el grupo de ASV. Estos resultados demuestran aún más la homogeneidad de las muestras entre las estaciones y la coherencia entre los conjuntos de datos del muestreador y de Niskin. Se asignó un total de 4308 secuencias al probable contaminante Ralstonia pickettii en todas las muestras del muestreador de ADNe; estos disminuyeron en recuento de 4308 en la muestra S1 a 80 en la muestra final S6.

Los resultados presentados en este artículo detallan las pruebas y el despliegue exitosos de un novedoso muestreador de ADNe. En comparación con las muestras simultáneas de la botella de Niskin, el muestreador capturó una comunidad casi idéntica tanto para bacterias como para fitoplancton en todas las estaciones. Esto a pesar de las diferencias en el protocolo, como el volumen filtrado y la resolución temporal, lo que coincide con estudios anteriores, que han mostrado resultados similares42,43. Un estudio reciente realizado con 3G ESP también demostró que los resultados eran equivalentes entre el muestreo autónomo y el manual44. Curiosamente, los volúmenes de muestra en el estudio ESP se invirtieron donde el muestreador autónomo filtró un volumen mayor (1 L) y el muestreo manual filtró un volumen menor (36–100 ml)44. Nuestro protocolo generó resultados comparables con un volumen de muestreo autónomo más bajo, lo que permite mantener el tiempo de muestreo al mínimo.

Otra diferencia entre el método de muestreo y Niskin es el prefiltro de 35 \(\upmu\)m instalado en la entrada del muestreador debido a las limitaciones de partículas en la bomba y las válvulas. Sin embargo, los resultados aquí muestran que el prefiltro no afectó los resultados ya que el muestreador aún recogió la comunidad en la columna de agua. Mantener el prefiltro es ventajoso porque permite que el muestreador permanezca en un tamaño pequeño y portátil, lo que permite un despliegue de campo más fácil, particularmente en embarcaciones pequeñas con poco espacio en cubierta. El prefiltro tampoco afectó los resultados debido a la obstrucción, debido al protocolo de limpieza y a los lavados previos a la muestra que incluyen un retrolavado a través de la entrada, empujando así el material fuera del prefiltro.

La única discrepancia notable entre las muestras fue que se encontró un ASV clasificado como Ralstonia picketti en todos los resultados de las muestras, pero en ninguno de los resultados de Niskin. Esta bacteria se encuentra comúnmente en el medio ambiente y es capaz de crecer en plásticos45, lo que significa que probablemente fue una forma de contaminación en el muestreador de pruebas anteriores. A pesar de la prevalencia de esta bacteria, los recuentos brutos y la abundancia relativa disminuyeron rápidamente en los muestreos posteriores, lo que indica que el protocolo de limpieza estaba eliminando la bacteria de las líneas con cada muestra. Por lo tanto, con la optimización, el protocolo de limpieza puede prevenir la contaminación en el futuro.

En este trabajo no se utilizaron controles negativos. Esto se debe a que las capturas de botellas Niskin actúan como mecanismo de control o comparación. Sin embargo, el sistema se puede configurar de tal manera que utilice las reservas Milli-Q integradas como mecanismo de control negativo. Suponiendo que el volumen de reactivos no sea una restricción, un modo de operación podría ser tener un blanco Milli-Q entre cada muestra, o 5 muestras y 4 blancos. El inconveniente de esto son los volúmenes potencialmente grandes de Milli-Q (control en blanco/negativo) que necesitarían implementarse y reemplazarse después de cada implementación.

En este estudio, se tomaron muestras de cada sitio una vez con el muestreador de ADNe y la captura de botella Niskin. Sin embargo, publicaciones anteriores demuestran que la composición bacteriana puede cambiar en una escala de tiempo semanal en Bedford Basin46. Ahora que se ha demostrado que la configuración inicial del muestreador de ADNe se puede implementar con éxito, los estudios de series temporales en una variedad de ambientes acuáticos permitirían conocer los cambios microbianos con una participación humana mínima. Más allá de los estudios de series temporales, también se puede realizar la implementación de múltiples muestreadores en réplicas para evaluar la repetibilidad entre instrumentos. Ambos tipos de estudios están actualmente planificados para 2023-2024 y se implementarán 6 muestreadores durante varios meses.

También se podrían utilizar estudios futuros para analizar el ARNe, a fin de aprovechar la ventaja de que el muestreador conserva los ácidos nucleicos inmediatamente después del muestreo. Aunque observamos un rendimiento excelente con RNAlater, sería beneficioso probar diferentes productos químicos para la conservación, ya que hay muchos laboratorios que utilizan otras soluciones como el tampón de Longmire47 y DNAgard\(\circledR\)16 para preservar sus muestras.

En conclusión, estos resultados demuestran la prueba y el despliegue exitosos de un novedoso muestreador de ADNe autónomo capaz de limpiar y conservar, e incluye un cartucho intercambiable en el campo. Estos aspectos son beneficiosos para la investigación y el monitoreo, particularmente en ubicaciones remotas y durante largos períodos de tiempo en áreas como las Áreas Marinas Protegidas (AMP). Los estudios futuros del sistema incluirán la optimización de la limpieza, así como la integración del fluorómetro y pruebas colaborativas del sistema en múltiples escenarios de implementación. En general, este muestreador de eDNA ampliará el uso de eDNA en programas de seguimiento, haciéndolo más accesible y conveniente que los métodos de muestreo tradicionales.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio del Centro Nacional de Información Biotecnológica, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA917080.

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Descargar referencias

Se expresa gratitud hacia el Supercúmulo Oceánico de Canadá (Proyecto OceanAware), el Programa de Asistencia a la Investigación Industrial del Consejo Nacional de Investigación de Canadá (NRC IRAP), el Programa de Becas Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales (NSERC) de Canadá, el Programa de Becas Postdoctorales Industriales Mitacs, el Fondo Canada First para la Excelencia en Investigación (CFREF) a través del Ocean Frontier Institute (OFI) y la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI). Agradecemos a la Dra. Jennifer Tolman por ayudarnos con el análisis de ADN y a la Prof. Ruth Musgrave por permitirnos unirnos a su transecto portuario. Agradecemos a Lee Miller y Mark Wright por sus contribuciones al diseño del chasis del muestreador de eDNA y a la representación de sus imágenes para su uso en este documento.

Estos autores contribuyeron igualmente: Andre Hendricks y Connor M. Mackie

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

André Hendricks, Colin Sonnichsen y Vincent Sieben

Dartmouth Ocean Technologies Inc, Dartmouth, NS, Canadá

Connor M. Mackie, Edward Luy, Colin Sonnichsen, James Smith, Iain Grundke, Arnold Furlong, Robert G. Beiko, Julie LaRoche y Vincent Sieben

Departamento de Farmacología, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

Mahtab Tavasoli

Facultad de Ciencias de la Computación, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

Robert G. Beiko

Departamento de Biología, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

Julie LaRoche

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Todos los autores contribuyeron a aspectos del diseño, fabricación y prueba del instrumento. AH, EL y CS crearon el diseño inicial, AH y CM realizaron la mayor parte del trabajo experimental, CM realizó el trabajo de campo con la ayuda de JS e IGIG hizo la ingeniería mecánica; AH y JS hicieron la ingeniería eléctrica. RB, CM y JLR realizaron análisis de datos genómicos. MT, RB, AF, JLR y VS adquirieron financiación y supervisaron el proyecto. Todos los autores escribieron, revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Vincent Sieben.

Arnold Furlong, Julie LaRoche, Mahtab Tavasoli, Robert Beiko y Vincent Sieben declaran tener acciones en DOT Inc. Connor Mackie, Edward Luy, Colin Sonnichsen, James Smith e Iain Grundke son empleados de DOT Inc. Andre Hendricks no tiene ningún interés financiero en DOT Cª

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Reimpresiones y permisos

Hendricks, A., Mackie, CM, Luy, E. et al. Muestreador de ADNe compacto y automatizado para el seguimiento in situ de entornos marinos. Representante científico 13, 5210 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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Recibido: 19 de diciembre de 2022

Aceptado: 25 de marzo de 2023

Publicado: 30 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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